[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）24-11-02
The Initial Exploration about Reverse Effect of Rapamycin on Multidrug Resistance of Human Breast Cancer Cell
SHEN Xiangdi QIU Rong FAN Xingli CHEN Jian LIU Dandan
Zhejiang Medical College， Hangzhou 310053， China
[Abstract] Objective To explore the reverse effect of rapamycin on multidrug resistance of human breast cancer cell MCF-7/ADR. Methods MTT was applied for detecting the proliferation rates of MCF-7 cells and MCF-7/ADR cells which treated by rapamycin （10μM）， ADM （10，50，100，500，1000，5000，20000，40000，100000ng/mL），or rapamycin combined with ADM. Results For the proliferation rate of MCF-7 cells，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （500，1000，5000，20000，40000，100000 ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin， the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 500 ng/mL. For the proliferation rates of MCF-7/ADR，rapamycin （10μM） did not affect it， ADM （40000，100000ng/mL） reduced it，and combined with rapamycin，the concentration of ADM which could reduce it was greater than or equal to 1000ng/mL. Conclusion Rapamycin could reverse the multidrug resistance of MCF-7 cells.
[Key words] Rapamycin； Breast cancer； Multidrug resistance； Reverse
雷帕霉素是丝氨酸-苏氨酸激酶（mTOR）的特异性抑制剂，可以通过阻滞肿瘤细胞生长周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤内血管生成过程等多种机制抑制肿瘤的生长，近来还有研究表明mTOR信号传导通路还与肿瘤的多药耐药有关[1，2]。本研究旨在研究雷帕霉素对乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR的耐药逆转作用。
1 材料与方法
1.1 细胞株
MCF-7细胞系（上海细胞库）；MCF-7/ADR细胞系（南京凯基生物发展有限公司）。
1.2 仪器和设备
酶标仪（Thermo MK3，美国），冷冻离心机（Beckman Coulter-Allegra 64R，德国），细胞培养箱（Heraeus公司，德国），超净工作台（上海博迅医疗设备厂）。
1.3 试剂
雷帕霉素（台州市晟欣医药化工有限公司），盐酸阿霉素（ADR，上海君创生物科技有限公司），MTT（Sigma公司，美国），RPMI1640（杭州吉诺生物医药技术有限公司），小牛血清（杭州四季青生物公司），DMSO（国药集团化学试剂有限公司），胰酶（杭州吉诺生物医药技术有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 MCF-7细胞在5%CO2、37℃条件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，待细胞长满瓶壁的2/3时，胰酶消化，传代培养。MCF-7/ADR细胞的培养基为含有0.5μmol/L ADR的RPMI1640培养液，在实验前两周停止加入ADR，其余培养方法与MCF-7细胞相同。取对数生长期的MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞分别用胰酶消化，调整细胞的浓度至5×103/mL，每孔100μL，接种于96孔板中。放置于37℃、饱和湿度的5%CO2培养箱24h后备用。
1.4.2 雷帕霉素对MCF-7细胞增殖活性的影响 根据文献用MTT法测定。采用1.4.1的方法准备MCF-7细胞，加药。共分两组，每组设4个复孔。①空白对照组；②雷帕霉素组：雷帕霉素的终浓度是10μM。24h后加入31.5μL的MTT（5mg/mL），培养4h后去除培养液，加入DMSO 200μL，震荡5min后，570nm测定每孔的吸光值（OD）。细胞增殖率＝OD实验组/OD对照组×100%。
1.4.3 雷帕霉素对MCF-7/ADR细胞增殖活性的影响 取1.4.1的方法准备的MCF-7/ADR细胞，采用1.4.2的方法计算出细胞增殖率。
1.4.4 阿霉素对MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞增殖活性的影响 细胞的增殖活性根据1.4.2的方法用MTT法测定，将准备好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞分别分组，每组设4个复孔。①空白对照组；②阿霉素组：加入25μL不同浓度的阿霉素，使其终浓度为10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，药物处理24h后，采用1.4.2的方法计算细胞增殖率。
1.4.5 雷帕霉素和阿霉素对MCF-7细胞增殖活性的影响 细胞的增殖活性根据1.4.2的方法用MTT法测定。取准备好的MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，分别分组，每组设4个复孔。①空白对照组；②实验组：加入25μL不同浓度的阿霉素，使其终浓度为10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng/mL，再加入终浓度为10μM的雷帕霉素，药物处理24h后，采用1.4.2的方法计算细胞增殖率。
1.5 统计学处理
数据经SPSS14.0软件处理。所有数据均采用平均值±标准差（χ±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 雷帕霉素对细胞增殖活性的影响
与对照组相比，10μM的雷帕霉素处理过的MCF-7细胞（t=1.30，P＞0.05）与MCF-7/ADR细胞（t=-1.70，P＞0.05）的增殖率均无显著差异。见表1。
2.2 不同浓度阿霉素对细胞增殖活性的影响
与对照组相比，MCF-7细胞经500ng/mL及以上浓度的阿霉素处理，细胞增殖活性有显著差异（P＜0.05）；而MCF-7/ADR细胞在40000ng/mL和100000ng/mL浓度的阿霉素处理下，细胞增殖活性与对照组相比，有显著差异（P＜0.05）。见表2。
2.3 雷帕霉素联合阿霉素对细胞增殖活性的影响
MCF-7细胞中加入500ng/mL及以上浓度阿霉素联合10μM雷帕霉素处理24h以后，细胞增殖率与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。而在MCF-7/ADR细胞中加入1000ng/mL及以上浓度阿霉素联合10μM雷帕霉素处理24h以后，细胞增殖率与对照组相比有显著差异（P＜0.05）。见表3。
3 讨论
在本研究中，10μM的雷帕霉素作用于MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞24h，与对照组相比，细胞增殖率没有显著差异，说明这个浓度的雷帕霉素作用细胞24h不会影响细胞增殖的活性，对这两种细胞都没有细胞毒性。同时，我们也检测了不同浓度的阿霉素对两种细胞的增殖活性影响。结果发现，500ng/mL及以上浓度的阿霉素作用于MCF-7细胞24h，细胞的增殖活性与对照组相比有显著差异，说明500ng/mL及以上浓度的阿霉素能降低MCF-7细胞的增殖。而对于MCF-7/ADR细胞，只有40000ng/mL和100000ng/mL的阿霉素处理24h后，细胞的增殖活性明显降低，其他浓度和对照组相比均无显著差异，这是MCF-7/ADR细胞具有耐药性所决定的。本研究的目的是初步探讨雷帕霉素对MCF-7/ADR细胞的多药耐药逆转作用。因此，在做了以上基础工作以后，我们将本身不产生细胞毒作用的10μM的雷帕霉素和不同浓度的阿霉素联合分别作用于MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞。结果发现，500ng/mL及以上浓度的阿霉素可以降低MCF-7细胞的增殖率；而单独阿霉素引起MCF-7细胞增殖率降低的浓度也是590ng/mL。而对于耐药细胞系MCF-7/ADR，与雷帕霉素联合后，1000ng/mL及以上浓度阿霉素可引起细胞增殖率的降低，抑制细胞的增殖；而单独用阿霉素，需要40000ng/mL及以上浓度才能抑制细胞的增殖。前述实验证明该浓度的雷帕霉素对细胞无直接毒性，说明加入雷帕霉素后，MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性增高。由本实验结果可以推论雷帕霉素能逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性。
在以往的研究中，膀胱癌多药耐药细胞系和B淋巴细胞多药耐药细胞系经雷帕霉素作用后，其多药耐药性均有所逆转[2，3]。而本实验也表明，在乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/ADR中，雷帕霉素也有此作用。多药耐药的逆转涉及多种机制，雷帕霉素对于乳腺癌细胞的作用机制具体是什么，还需要进一步研究。
[参考文献]
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化疗作为恶性肿瘤临床治疗的重要手段而被广泛应用，其所致副反应以白细胞减少最为常见。化疗致白细胞减少易引发感染，导致化疗疗程的推迟与剂量的减小[1]，这不仅影响肿瘤患者的生活质量[2]，还威胁着患者生存周期与预后[3]。因而，化疗所致白细胞减少也就成为临床的常见问题。现代医学对于化疗所致白细胞减少的治疗主要以刺激骨髓造血为主，临床使用的药物以粒细胞集落刺激因子为主。近年来，中药对于化疗后引起的白细胞减少的疗效也逐渐被患者接受，而关于其机制的研究亦逐渐深入。本文就其机制进行探讨。
1 传统中医理论
中医理论认为，化疗药物为热毒之邪，作用于机体导致伤津耗气，阴津亏损，津血同源，气血双亏，阴阳俱虚，脏腑亏损。表现为乏困无力，头晕目眩，夜卧不寐，或失眠多梦，五心烦热，易受外感风寒之邪入侵，属于中医学“虚劳”的范畴，证型多以气血亏虚为主。《灵枢・海论》曰：“髓溢不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”《医学入门》曰：“食少神昏，精不荣，腰背胸胁筋骨酸痛，潮汗咳嗽，此虚证也，但见一二便是。”上述描述与白细胞减少的症状相似。中医经典理论认为，虚劳以脾肾虚损为主，肾为先天之本，藏精生髓，肾虚则精髓不生；脾为后天之本，气血生化之源，脾虚则气血生化乏源，气血不足，表现多有乏力、头晕、少气懒言、低热盗汗等症。因此，治疗以补虚为主，针对病因病机，健脾补肾、益气养血等治法对于白细胞减少的治疗有明显疗效。
2 现代医学研究
2.1中药对骨髓细胞增殖的影响
骨髓细胞增殖功能的良好与否决定了外周血象是否正常。骨髓细胞增殖存在细胞周期，而其调控机制中有两个重要的检查点，分别位于G1期与S期、G2期与M期之间。陈志伟等[4]研究显示四物汤配方颗粒各组均能明显促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞转化，增殖指数（PI）明显升高。郑轶峰等[5-6]研究表明右归丸低、高剂量均能促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞的转化，提高G2/M期细胞比例，增殖指数（PI）明显升高。左归丸各剂量组均能促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞的转化，从而导致G2/M期细胞比例和增殖指数（PI）明显升高（P
2.2中药对骨髓造血微环境的影响
造血细胞的存活、增殖、分化、成熟与释放均受骨髓造血诱导微环境的影响，其中，与造血调控密切相关的细胞成分主要是微环境中的巨噬细胞、网状细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞、脂肪细胞等。吴岩等[7]实验发现当归补血汤能够促进内皮细胞由静止期进入增殖期，能促进IL-6和GM-CSF的分泌。当归补血汤通过促进内皮细胞增殖，将内皮细胞分泌的各种造血细胞因子与细胞外基质结合，构成一个支持造血的复杂网络，把造血干细胞固立于局部，使造血干祖细胞受局部高浓度细胞因子的作用而增殖与分化，参与造血调控[8]。
2.3中药对造血因子的影响
骨髓微环境中的基质细胞所分泌的多种细胞因子，如SCF、GM-CSF、G-CSF、M-CSF以及白细胞介素等，这些因子对造血干细胞的增殖、分化和发育起调控作用。IL-6是一种主要由免疫活性细胞分泌的多功能因子，不仅具有免疫调节及抗肿瘤作用，且能促进细胞的增殖分化、加速血小板的再生，具有显著的造血调控作用。袁晓辉[9]研究表明六君子汤能诱导小鼠细胞因子的释放，实验中病理小鼠血液中IL-6活性表现出明显降低，在运用六君子汤治疗后第5、10天具有显著升高IL-6水平。
综上所述，传统中医理论的证候分析及现代医学分子生物学的相关实验研究，均说明中药对于化疗后引起的白细胞减少的治疗有效，而临床大量病例亦证明了化疗后配合中医中药治疗能够改善白细胞减少，提高患者的生存质量。随着肿瘤治疗理念的变化，中医治疗也逐渐成为肿瘤综合治疗中的重要手段被患者所接受。对于化疗引起的其他不良反应，中医中药能否提供更多的有效治疗及其机制有待于我们进一步探讨。
参考文献：
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[5] 郑轶峰，张力华，秦剑，等.右归丸对骨髓抑制小鼠造血功能的影响[J].浙江中西医结合杂志，2009，19（4）：212-215.
[6] 郑轶峰，张力华，周毅.左归丸对骨髓抑制小鼠造血调控的影响[J].河北中医，2009，19（4）：212-215.
【关键词】 西洋参叶二醇组皂苷；血管平滑肌细胞；血管紧张素II
冠状动脉粥样硬化（AS）的主要病理变化是血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖〔1，2〕。诱导VSMC增殖因素有很多，其中较重要的因素为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）。AngⅡ是肾素血管紧张素系统（RAS）中重要的生物活性肽，经过一系列细胞信号转导可诱导细胞增殖〔3〕。西洋参叶二醇组皂苷（PQDS）是五加科人参属植物，有抗心肌缺血、缩小心肌梗死面积的作用〔4〕。目前尚未有文献报道PQDS对VSMC增殖的影响，本文就PQDS对VSMC增殖的干预作用进行研究。
1 材料与方法
1.1 试剂及材料
Wistar大鼠3只，雄性，120～150 g。PQDS粉末、AngⅡ（Sigma公司），胎牛血清FBS、RPMI1640培养基、Trizol（Gibco公司），兔抗大鼠平滑肌肌动蛋白（αSMA）（美国Lab vision公司），SP抗兔试剂盒、DAB显色试剂盒（中杉金桥生物工程有限公司），MTT、碘化丙锭、RNA酶（Sigma分装）。
1.2 VSMC的培养及鉴定
用组织贴块法进行中层VSMC培养，当细胞铺满培养瓶底80%以上时，传代培养，取第3～6代培养物，经兔抗大鼠αSMA免疫组化染色鉴定，阳性细胞＞98%，证实培养的是VSMC，实验用5～10代VSMC。
1.3 分组
将细胞随机分为5组，空白对照组：正常VSMC组；AngⅡ模型组：AngⅡ 10-7 mol/L，PQDS高剂量组（PQDS1）：PQDS 100 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L； PQDS中剂量组（PQDS2）：PQDS 50 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L；PQDS低剂量组（PQDS3）：PQDS 25 mg/L+ AngⅡ 10-7 mol/L；以上各组细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。
1.4 MTT法检测细胞增殖能力
用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为200 μl。将培养板放入CO2孵箱中37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，培养24 h，待培养细胞贴壁后，吸去培养液。按照上述分组中的给药，各组细胞在10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于CO2孵箱中37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养48 h。弃去培养液，每孔加入MTT溶液20 μl，37℃继续培养4 h后终止培养，吸弃培养上清液，每孔加150 μl二甲基亚枫（DMSO），振荡10 min。然后选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果。
1.5 流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数
将细胞接种在培养瓶中，培养24 h，后换无血清RPMI1640培养液作用24 h，使细胞同步化于G0期。按前述分组方案加药处理后，继续培养48 h，然后收集细胞，离心1 000 r/min×5 min，弃上清。用4℃预冷的70%冷乙醇固定18 h，之后调整细胞浓度为1×106细胞/ml，PI染色37℃孵育30 min后进行流式分析，应用ModFit LT3.0软件分析细胞周期中各期细胞所占总细胞的百分率；计算细胞增殖指数（PI），PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。
1.6 统计学处理
采用SPSS软件进行统计处理，所有计量数据以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）、SNK检验进行差异的统计学处理。
2 结 果
2.1 VSMC的鉴定
用倒置相差显微镜和SMA免疫组化染色，对VSMC进行鉴定。细胞培养3～5 d后，用相差显微镜观察可见少量细胞自组织块边缘游离出来，细胞呈梭形或长梭形排列，然后细胞呈放射性生长，长轴与组织块边缘垂直，多为两极，胞浆均匀，可见圆形细胞核及分裂相。至培养10 d左右出现局部成束的细胞平行排列，部分区域细胞重叠，部分区域高低起伏呈“峰、谷”状生长。SMA染色发现>98%的细胞染色呈阳性，即细胞浆内呈现棕黄色反应，胞核不着色，表明细胞含有SMA，证明培养的细胞为VSMC。见图1。
2.2 PQDS对VSMC增殖能力的干预
AngⅡ模型组OD值(0.862 5±0.06)比空白对照组(0.791 3±0.04)明显升高（P
2.3 PQDS 对VSMC的细胞周期及PI的干预
AngⅡ模型组较空白对照组G0/G1期VSMC百分率明显减少（P
3 讨 论
目前临床上抑制VSMC增殖的药物有钙离子拮抗剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、免疫抑制剂雷帕霉素、降脂药普罗布考等〔5〕，但抑制VSMC增殖的中药开发得较少。中药是祖国医药的神奇宝藏，在中医整体理论的指导下，可发挥多靶点、多成分协同作用的优势，疗效显著、价格低廉、毒副作用小。因此，开发抑制VSMC增殖的安全有效的中药及探讨抑制VSMC增殖的机制有重要意义。
AngⅡ是肾素血管紧张素系统中最重要的生物活性肽，不仅是血管活性物质引起机体血流动力学改变，而且通过自分泌、旁分泌刺激VSMC增殖〔6〕。本实验用AngⅡ诱导VSMC增殖，MTT法观察到AngⅡ模型组OD值比空白对照组明显增高，说明AngⅡ促进VSMC增殖，表明实验造模成功。本文通过流式细胞仪技术，发现AngⅡ 使G0/G1期的VSMC百分率明显减少，S期、G2/M期的VSMC百分率明显增加。证实AngⅡ促使VSMC从G0/G1期进入到S期、G2/M期，诱导细胞增殖。
西洋参茎叶皂苷（PQS）系五加科人参属植物，包括PQDS和三醇组皂苷等。研究证明PQDS可增加急性心肌梗死犬心肌血流量，降低冠脉阻力，明显降低心肌耗氧量、心肌氧摄取率及心肌耗氧指数〔7〕，可增加小鼠心肌 Rb摄取率，增加心肌营养性血流量〔8〕，可明显缩小心肌梗死面积，减少血清中肌酸磷酸激酶（CPK）及乳酸脱氢酶（LDH） 活性〔9〕 。本实验证明PQDS对VSMC增殖有抑制作用。PQDS组OD值明显比AngⅡ组减低，说明PQDS可抑制细胞增殖。PQDS各组可增加G0/G1期VSMC的百分率，减少S期、G2/M期VSMC的百分率，减少增殖指数，阻断细胞由G0/G1期向DNA合成的S期、G2/M期转化。说明PQDS可抑制VSMC的增殖，可将VSMC细胞抑制在G0/G1期，进而证明PQDS通过抑制VSMC增殖而起到对AS的防治作用。
参考文献
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细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。
1材料及方法
1.1试剂
重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。
1.2实验方法及结果
1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。
1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc, cfos和cjun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。
图1 表皮细胞正常光镜图
2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。
图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达
rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。
图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达
2讨论
表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高, cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。
【参考文献】
1 jahovic n, guzel e, arbak s et al. the healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (egf): role of the neutrophils[j]. burns, 2004, 30(6): 531538.
细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。
1材料及方法
1.1试剂
重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi?1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。
1.2实验方法及结果
1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。
1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入c?myc, c?fos和c?jun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。
图1 表皮细胞正常光镜图
2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。
图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达
rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，c?myc的标记率和表达量明显升高, c?fos和c?jun表达量也明显升高，结果见图3。
图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达
2讨论
表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现c?myc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。c?fos基因蛋白c?fos可以识别和结合到基因组定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。c?jun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后c?myc的标记率和表达量明显升高, c?fos和c?jun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。
【参考文献】
1 jahovic n, guzel e, arbak s et al. the healing?promoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (egf): role of the neutrophils[j]. burns, 2004, 30(6): 531?538.
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KEYWORDS: urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; after cataract
0 引言
人尾加压素Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）具有多种生物学效应[1, 2]。体内多种组织中含有U?Ⅱ，我们的研究也发现，眼部各组织均含有U?Ⅱ。不少研究还表明，U?Ⅱ具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症之一是视力再度下降，称为后发性白内障 (after cataract)。这是由于手术后残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊所致。本文研究U?Ⅱ对晶状体上皮细胞增殖的影响，探讨后发性白内障的发生机制并寻求防治方法。
1 材料和方法
1.1 材料
采用健康新鲜小牛眼，无菌操作取晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法在37℃，5%CO2培养箱中作晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ为美国Sigma公司产品，3H ?胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，二甲基亚砜（DMSO）系美国Amresco公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基 ?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品。全自动酶标读数仪(购自美国BioTek ELX808)。
1.2 方法学术
1.2.1 LEC活性的检测
取第3代培养的LEC，台盼蓝染色，计算活细胞数并调整细胞密度至5×108个/L，在37℃，5% CO2培养箱中常规培养24h，使细胞同步化。将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC内加入DMEM培养液，10?10U?Ⅱ组，10?9U?Ⅱ 组，10?8U?Ⅱ组，10?7U?Ⅱ组和10?6U?Ⅱ组分别在对照组基础上加入终浓度为10?10mol/L,10?9mol/L,10?8mol /L,10?7mol/L和10?6mol/L的hU?Ⅱ。置CO2培养箱中继续培养72h后，吸去培养液，每孔分别加入终浓度为0.5g/L的MTT 100μL。CO2培养箱中继续放置4h后，加入DMSO溶液100μL，振荡10min后室温下静置5min，于全自动酶标仪上用490nm比色测定吸光度A值。
1.2.2 LEC增殖的检测
取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。按照上述实验分组，分别加入不同浓度的hU?Ⅱ，每组8个样本，CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
统计学分析:用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差（±s）来表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。
2 结果
2.1 U?Ⅱ可增加LEC活性
10?10mol/L U?Ⅱ组的吸光度值与对照组无显著差异(P>0.05)，说明10?10mol/L U?Ⅱ不能使LEC活性增高。10?9mol/L，10?8mol/L，10?7mol/L和10?6mol/L 组U?Ⅱ的吸光度值均显著高于对照组(P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01)，其吸光度值分别是对照组的 1.26倍、1.40倍、1.45倍和2.05倍。说明10?6mol/L～10?9mol/L U?Ⅱ均有使LEC活性增高的作用，且随U?Ⅱ 浓度增加，使LEC活性增高的作用越强，呈浓度依赖关系（表1）。表1U?Ⅱ对LEC活性和增殖的影响(略)
2.2 U?Ⅱ可促进LEC增殖 学术
10?10mol/L U?Ⅱ组，10?9mol/L U?Ⅱ组，10?8mol/ L U?Ⅱ组，10?7mol/L U?Ⅱ组和10?6mol/L U?Ⅱ组的U?Ⅱ3H掺入放射活性（个/min）均显著高于对照组(P<0.01)，其放射活性分别是对照组的1.36倍、1.40倍、1.45 倍、1.59倍和1.66倍。说明浓度范围在10?6mol/L～10?10mol/L 的U?Ⅱ均有使LEC增殖的作用，且随U?Ⅱ 浓度增加，使LEC增殖的作用越强（F=17.893，P<0.05 ），呈浓度依赖关系（表1）。
3 讨论
研究表明U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质。除了具有很强的收缩血管的作用之外，U?Ⅱ还具有促进细胞增殖的作用。有报道U?Ⅱ可明显促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖，使G0期细胞进入细胞周期。U?Ⅱ还能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性[4]。另有研究表明，U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉VSMC发生增殖、呈浓度依赖关系。且降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。
经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进眼组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞增殖的报道。本研究用不同浓度的U?Ⅱ与体外培养的牛晶状体上皮细胞共同孵育，经MTT法检测发现U?Ⅱ使LEC细胞活性显著增高；经3H?TdR掺入法检测发现U?Ⅱ能显著促进LEC发生增殖。且在一定的浓度范围内，随着 U?Ⅱ浓度增高，其所促进的LEC活性增高越明显、促进LEC增殖越明显，即U?Ⅱ促进LEC增殖呈明显的浓度依赖关系。
检测细胞增殖这一重要生物学特性的指标有细胞计数法、MTT检测法、放射性核苷酸掺入法等。MTT法检测细胞活性从而反映细胞增殖的原理是：细胞增殖时由于线粒体能量代谢旺盛、产生的琥珀酸脱氢酶增多，该酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的结晶沉积在细胞内或细胞周围，因此细胞增殖时形成的结晶多。在结晶中加入二甲基亚砜使结晶溶解后即可在酶标仪上比色读得吸光度值。故吸光度值越高，表示活细胞数越多、细胞增殖越明显。 3H?TdR掺入法检测细胞增殖的原理是：用放射性同位素 3H标记的胸腺嘧啶掺入细胞内，再用γ?液闪计数仪测定 3H放射活性。如3H?TdR掺入细胞增加，则测得的 3H放射活性高，反映细胞内DNA合成增多、说明细胞发生了增殖。本研究采用MTT法和3H?TdR掺入法检测LEC增殖，两种方法的研究结果是一致的，均表明U?Ⅱ能促进LEC发生增殖，并呈浓度依赖关系。
后发性白内障的基本病理过程是白内障手术后残留的LEC发生增殖，同时移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及Soemmering环，并向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊而使白内障术后视力再度下降。本项目组的其他研究曾发现U?Ⅱ在人眼各组织中均有一定的含量。我们又发现U?Ⅱ能促进体外培养的 LEC发生增殖，揭示U?Ⅱ促进手术后残留的晶状体上皮细胞发生增殖很可能是后发性白内障发生的重要机制之一，为防治后发性白内障提出一个新的思路，具有一定的科学意义。
【参考文献】学术
1 Matsushita M, Shichiri M, Fukai N, et al. Urotensin Ⅱ is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line. Endocrinology 2003;144(5):1825?1831
2 Maguire JJ, Kue RE, Davenport AP. Ophen?receptor ligand human urotensin Ⅱ: receptor localization in human tissues and comparison of vasoconstrictor responses with endothelin?1. Br J Pharmacol 2000;131(3):441?446
3 张勇刚，陈亚红，马春艳，等．尾加压素的促丝裂作用．中国动脉硬化杂志2001;9(1):14?16
4 夏春芳,霍勇,尹航, 等．IL?10对尾加压素Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．北京大学学报(医学版) 2001;33(4): 332?334
【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
兔抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、鼠抗pSTAT3tyr705单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品；RPM为美国惠氏百宫制药公司惠赠。
1.3 各组术后生存分析
1.4 肝功能指标检测
1.5 兔抗增殖细胞核抗原、α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测
肝组织常规固定、包埋、切片。采用兔抗增殖细胞核抗原作为细胞增殖期G1S期的评价指标，α平滑肌肌动蛋白作为肌纤维母细胞标志。按ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒说明书操作。显微镜下观察α平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞的胞质呈棕色，增殖细胞的胞核呈棕色。计算7个高倍镜(×400)视野内，每100个胆管细胞中增殖的胆管上皮细胞所占比例的均值作为该样本的胆管上皮细胞增殖率［4］。
1.6 统计学分析
计量资料以±s表示，所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，采用KaplanMeier法绘制生存曲线，Logrank法检验各组生存率之间的差异。
2 结果
2.1 各组术后生存分析
冷保存12 h组生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4)，而与雷帕霉素组水平接近(P=0.89，图1)。两组大鼠死亡的主要原因为移植肝肝功能不全，表现为肝脏淤血或伴有局灶性坏死，腹水、黄疸，肝功能酶谱升高，部分死亡大鼠胆管内可见褐色胆泥形成。
图1 各组肝移植术后生存曲线
2.2 各组肝功能检测
2.3 各组胆管上皮细胞增殖
2.4 胆管周围肌纤维母细胞分布
图2 肝移植术后胆管上皮细胞增殖(红色箭头所示为增殖细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)
图3 肝移植术后肌纤维母细胞分布(红色箭头所示为肌纤维母细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)
3 讨论
残存的胆管上皮细胞在对损伤做出再生修复时，虽然最终能恢复到近似原先的细胞形态，但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列改变，具有和正常细胞不同的功能，分泌多种与器官纤维化密切相关的细胞因子如TGFβ等，促进胆管周围成纤维细胞活化转化为肌纤维母细胞，而后者的持续出现是器官纤维化过程的关键［6］。同时，大量而活跃的细胞分裂需要消耗较多的能量，就有可能削弱肝内非新生细胞正常的能量代谢过程［7］。这对移植物的长期存活及功能是不利的。我们观察到伴随着明显的胆管上皮细胞增殖，较多肌纤维母细胞环绕于冷保存12 h组胆管周围。这表明严重冷保存再灌注诱导的胆管上皮细胞增殖可能是促进肌纤维母细胞聚集的重要因素。由于胆管上皮细胞和胆管周围肌纤维母细胞之间维持着非常精妙的平衡，冷保存再灌注对胆管上皮细胞的严重损伤触发肌纤维母细胞的大量活化，导致胆管壁创面收缩，增加了胆管壁及其周围组织纤维化和胆管狭窄形成的风险，在肝外胆管或肝内大胆管常表现为管腔狭窄，在小胆管则可能出现管腔阻塞［8］。我们还观察到大胆管尤其肝门附近大胆管内壁的胆管上皮细胞增殖最为活跃，该区结缔组织丰富，内含大量成纤维细胞，极易受到胆管上皮细胞增殖的影响而活化为肌纤维母细胞。这也许正是临床观察到的肝门附近大胆管成为移植肝胆道狭窄易患部位的原因之1，也是影响移植物功能与存活的重要因素。
作为1种新型免疫抑制剂，体外和体内实验均证实雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖，其有效抑制浓度远低于临床肝移植术后患者应用雷帕霉素作为免疫抑制剂时的血药浓度［9］。我们的研究也发现，雷帕霉素明显抑制由冷保存再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞增殖，并减少胆管周围肌纤维母细胞的聚集。雷帕霉素是信号转导及转录激活因子3活化的特异性抑制剂，因而部分阻断转录激活因子3介导的信号通路，从而调控细胞周期进展，影响细胞增殖与分化［10］，这可能是其抑制胆管上皮细胞增殖的分子机制之1。同时我们还观察到，雷帕霉素虽然明显抑制肝移植术后胆管上皮细胞的增殖，但并未降低术后14 d内生存率，进1步提示以胆管上皮细胞增殖为靶点的雷帕霉素极可能成为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症的有力武器，将会更广泛地应用于肝移植领域。
【参考文献】
Abstract Objective: The purpose of the present was to investigate the effect of pilose antler polypeptides(PAP) on the proliferation of rat chondrocyte in vitro.Methods: The rat articular chondrocytes were isolated by enzyme digestion and sub-cultivated in serial.The 4th chondrocyte was interfered with PAP.The chondrocytes of different generations and the 4th medicine intefered generation were detected with the methods of proliferating cell nuclear antigen ， MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) assay for proliferation and Flow cytometry for analyses of cell cycle distribution and PI(proliferation index).Results: With chondrocytes passage time increasing， the proliferating ability of chondrocytes descended.MTT assay showed that the proliferating ability of chondrocytes decreased， the expression of PCNA tapered in the experiment of immunohistochemistry， and PI descended in flow cytometry for analyses.PAP can inhibit the tendency and strengthen the proliferating ability of chondrocytes in serial subcultivation.Conclusion: PAP can significantly improve proliferation of chondrocytes in serial subcultivation.
Key words Pilose antler polypeptides(PAP); Rat; Chondrocyte; Proliferation
关节软骨缺损是临床上常见的损伤，它可导致关节面不平整，从而继发骨性关节炎。用组织工程软骨修复关节软骨缺损是目前正在尝试的一种新方法，具有良好的发展潜力。关节软骨细胞是组织工程理想的种子细胞，但如何分离获取数量多、活性高、分化良好的软骨细胞是组织工程培养技术中的重要问题之一。近年来对生长因子在关节软骨形成和退变过程中的作用日益受到重视，并开展了广泛的研究，认为种子细胞需要适应生长因子的调控才能获得良好的生物活性。由于鹿茸生长的特殊性，故人们推测鹿茸中可能存在某种活性物质控制并刺激鹿茸生长。鹿茸多肽（PAP）是从梅花鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成份。因此，本研究采用体外培养大鼠软骨细胞的方法，观察PAP对其增殖的影响，为优化组织工程的种子细胞提供一定的理论和实验依据。
1 材料
1.1 实验动物 SD大鼠（闽验证字20050001，合格证号2005C03），清洁级，福建医科大学实验动物中心提供，3～4周龄，体重180～200g，皆为雄性，共8只。
1.2 主要试剂 αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清（FBS，HyClone公司）；胰蛋白酶1∶250(Trypsin，Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；噻唑蓝（MTT，上海申能博采公司），二甲基亚砜(DMSO，Amersco公司)；增殖细胞核抗原PCNA(美国NeoMarkers公司)；PAP粉针由长春中医学院赵文海教授惠赠。
2 方法
2.1 大鼠软骨细胞的获取、鉴定与药物干预分组情况 取4周龄体重180～200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等［1］软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境、37℃恒温箱内单层培养，隔3日首次换液，8～10 天达85%融合后进行传代培养。以传代次数（passage，P）分组，P0即原代细胞，P1即第1次传代后细胞，P2即第2次传代培养细胞，余类推。软骨细胞鉴定采用阿力新蓝染色法检测GAG合成、免疫组化法及RT－PCR法检测Ⅱ型胶原表达［2］。实验分组为P2组、P3组、P4组及鹿茸多肽不同剂量组（低、中、高不同药物浓度干预后的P4软骨细胞组），鹿茸多肽干预组分组的方法采用传代分组法：倒置相差显微镜下进行观察，当P3代软骨细胞融合达到85%时，进行传代（1传3），以胰酶消化贴壁细胞，反复吹打，使细胞均匀悬浮，离心（1 500rpm，5分钟），洗涤2次；对αMEM（含5%FBS）进行加药，分别配制含不同浓度的PAP培养基，分别加药使各瓶培养基药物终浓度为PAP 5μg/mL、PAP 10μg/mL、PAP 15μg/mL；分别以上述不同含药浓度培养基吹打混匀各瓶P3细胞，进行传代，使药物干预组软骨细胞进入P4代。按实验要求调整细胞浓度，分别接种软骨细胞于底面积25cm2培养瓶（细胞浓度5×105/mL）、6孔培养板（置入盖玻片）（细胞浓度5×105/mL）、96孔培养板（细胞浓度4×105/mL）， 于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中孵育，其中PAP分组参考剂量来源于前期实验［3］。
2.2 各代软骨细胞MTT比色试验 将不同代次大鼠软骨细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24小时后用含体积分数为5%FBS的αMEM培养，并分别加入PAP，使PAP终浓度为5、10、15μg/mL，加药后分别继续培养48小时 ，加入MTT溶液呈色。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各个孔光吸收值。
2.3 各代软骨细胞周期分析及增殖指数检测 将培养的待测各代软骨细胞分别置5mL试管中，用PBS或生理盐水洗2次，制成单细胞悬液，无水乙醇固定细胞，加入PBS调整细胞浓度为5×105～5×106个细胞加入1mL DNA荧光染料（PI），室温下避光染色15分钟，以流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan，美国)分析各代软骨细胞周期及检测增殖指数。
2.4 各代软骨细胞免疫细胞化法检测各组软骨细胞PCNA表达 将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48小时后取出盖玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况，结果分析：采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统进行图像分析，测定PCNA阳性信号的面积密度( Sv =PCNA阳性信号面积和/窗口面积×窗口数)。
2.5 统计学方法 以上检测均随机取多个样本，每个样本多次重复。应用SPSS11.0统计软件进行分析。进行Oneway ANOVA检验和Pearson相关分析，定量资料实验结果以均数±标准差表示，P
3 结果
3.1 各组软骨细胞MTT比色结果 MTT比色分析显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中细胞能量代谢呈下降趋势，逐代相比OD值有显著差异（P
图1 各组软骨细胞在不同观察时间点的增殖情况(OD值)（略）
3.2 各组软骨细胞细胞增殖指数结果 流式细胞术实验结果显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代细胞，细胞增殖指数呈下降趋势，分别为20.9%、16.8%、12.6%，PAP干预后的P4各组细胞增殖指数高于P4细胞，分别为19.7%、21.4%、19.4%，其中PAP 10μg/mL组促进软骨细胞增殖的作用最高，见图2。
图2 各组软骨细胞细胞周期PI值（略）
3.3 各组软骨细胞PCNA检测结果 免疫细胞化学法检测各组软骨细胞PCNA表达显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中的阳性表达呈下降趋势，逐代相比其阳性表达有显著差异（P
图3 各组软骨细胞PCNA表达（略）
A：P2(×400)，B：P3(×400)，C：P4(×600)，D：PAP 10μg/mL(×400)
图4 各组软骨细胞PCNA阳性表达面积密度比值（略）
4 讨论
鹿茸具有很强的壮肾阳、益精血、强筋骨的作用，是重要的滋补强壮中药。从药理上分析，鹿茸内含有丰富的多糖类、氨基酸类、脂肪酸类物质以及多种生长因子及其它营养成分，可以为软骨细胞的生长提供充足的营养条件。鹿茸是一种特殊的骨组织，在春季生发季节以1～2cm/d的速度生长，故推测鹿茸中可能存在生长因子促进骨质和表皮层的增殖。目前王本祥研究室应用凝胶过滤和离子交换层析等技术，从梅花鹿茸中分离纯化出一种多肽，经高效液相色谱和N-末端氨基酸分析鉴定为单一多肽，氨基酸组成分析证明，PAP是由68个氨基酸残基组成，分子量为7 200［4］。此多肽主要含有缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸，没有半胱氨酸。实验证明PAP具有很强的促进骨、软骨细胞增殖的作用［5-6］。实验所见软骨细胞在体外传代培养过程中细胞增殖能力呈下降趋势，本实验从MTT比色分析细胞能量代谢，流式细胞术考察其增殖期细胞含量，免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原表达等方面看到从P2代细胞至P4代细胞，软骨细胞增殖能力明显下降，如何以生长因子刺激促进软骨细胞的增殖能力对于将软骨细胞作为种子细胞用于软骨组织工程具有积极意义。生长因子对靶细胞的调控与其剂量密切相关，因此，确定能产生最佳调控软骨细胞增殖的PAP剂量至关重要。本文在预实验的基础上用MTT比色试验所筛选的不同剂量的PAP能不同程度地促进软骨细胞的能量代谢。说明PAP能促进软骨细胞增殖，而且以10μg/mL浓度为最佳。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达和合成与细胞周期有关。主要表达增殖细胞的S期、G1期、G2初期，因此成为检测细胞增殖活性最为有效的标志之一。本实验免疫组化结果证实，PAP以10μg/mL浓度时软骨细胞表达致密的棕褐色颗粒最多，其他组则较少，说明PAP可通过促进PCNA表达来调控DNA复制。细胞周期与细胞中DNA含量密切相关，DNA含量随着细胞周期各期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。细胞增殖指数是S期与G2期DNA含量之和与S期、G2及G1期DNA含量之和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本实验FCM结果显示，PAP能显著提高软骨细胞增殖指数，且以10μg/mL浓度时最明显。综上所述，PAP不仅具有显著的生物活性，可以促进软骨细胞的增殖，而且还能阻止软骨细胞在连续体外培养过程中的增殖衰老趋势，本实验可以为优化组织工程中的种子细胞提供一定理论和实验依据，有关PAP抗软骨细胞传代老化的实验有待进一步探讨。
参考文献
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［3］ 林建华，修忠标.鹿茸多肽对骨髓基质干细胞体外增殖的影响［J］.中华实验外科杂志，2005，22(7):821-828.
【关键词】 N-乙酰半胱氨酸 血管紧张素Ⅱ 活性氧 ECV304细胞 增殖
【Abstract】 Objective To explore the role of reactive oxygen species in the proliferation of ECV304 induced by AngⅡ.Methods The lines of human umbilical vein endothelial cell(ECV304) cultured in vivo were divided into three groups which were treated by AngⅡ，Ang Ⅱ+N-acetyl-L-cysteine(NAC)，and normal culture medium.First we observed the proliferous effect of ECV304 induced by AngⅡ at different concentration with improved MTT and microscope.Then the contents of ROS(·OH) in three groups were detected by spectrophotometer.Results ECV304 incubated with Ang Ⅱ(0.03125～1μmol/L) for 12 hours increase the proliferation rate (P<0.05 vs control group);It is significant that the negative correlation between proliferation rate and the content of ROS(·OH);NAC(10mmol/L) can inhibit the proliferation of ECV304 induced by AngⅡ(P>0.05 vs control group).Conclusion ECV304 induced by AngⅡ can produce ROS(·OH)，and the contents of ROS(·OH) increase with the prolongation of time and the enlargement of dose;Antioxidant NAC can inhibit the proliferation of ECV304 induced by AngⅡ，this effect may be related with reducing the content of ROS(·OH);ROS(·OH) may be one of the major mocleculars which play an important role in the signal transduction of ECV304 proliferation.
【Key words】 NAC Ang Ⅱ ROS ECV304 proliferation
血管内皮是心血管疾病危险因子的靶点，其功能障碍构成许多心血管疾病的病理基础。目前认为血管自稳态的调节取决于血管内皮自身的氧化还原状态［1，2］。大量研究表明，氧化应激产生的各种活性氧(reactive oxygen species，ROS)对血管内皮具有细胞毒性作用，是许多心血管疾病发生的重要机制［3，4］。然而，新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时，可作为血管内皮信号转导分子，参与调节细胞功能［5］。本研究以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为血管氧化应激的诱导剂，观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)增殖作用的影响，探讨活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用，为心血管疾病的防治提供新的理论依据，启示新药研发和应用的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料 ECV304(人脐静脉内皮细胞株)购自中国科学院上海药物研究所；AngⅡ、NAC和MTT(批号9710)购自Sigma公司；特级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所(批号20020114)；·OH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20030625)。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 (1)AngⅡ处理组：a.不同作用时间(4h、12h和24h)；b.不同浓度(Ang Ⅱ终浓度分别为，0.03125μmol/L、0.0625μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L)；(2)NAC干预组：AngⅡ 1μmol/L+NAC 10mmol/L;(3)正常对照组：加入等量完全培养基。
1.2.2 ECV304细胞传代培养 ECV304细胞在含20%小牛血清的RPMI1640完全培养基中，37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养。台盼蓝染色后计算细胞存活率(Via=99%)，调整细胞悬液浓度为1×106个细胞/ml备用。
1.2.3 改良MTT法测定ECV304细胞增殖率 将备用的细胞悬液接种于96孔板，90μl/孔，每组设4个复孔。4h细胞完全贴壁后加入受试药物，10μl/孔(倍比稀释AngⅡ，使其终浓度为1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L、0.125μmol/L、0.0625μmol/L和0.03125μmol/L)。置于培养箱中分别培养4h、12h和24h，之后每孔加入MTT液(5mg/ml)10μl，4h后分别在每孔加入三联液［10%十二烷基硫酸钠-5%异丁醇-0.012mol/L盐酸(w/v/v)］100μl/孔，置于培养箱中12h后，用EL340酶联免疫仪在570nm单波长下测定每孔的OD值。
细胞增殖率(%)=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%
1.2.4 ECV304细胞光镜形态学观察 分别用含有AngⅡ(浓度分别为0.0625、1μmol/L)、NAC(1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC)的培养基和完全培养基培养，12h后置倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
1.2.5 ECV304细胞内·OH含量测定 将上述所得的细胞悬液与不同浓度的AngⅡ分别共同培养12h和24h，应用检测试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。
1.2.6 统计学处理 应用SPSS12.0软件包进行分析，分别对各个实验组进行单因素方差分析，当P<0.05时，进一步作任一两均数的比较用q检验；对不同时间(12h和24h)的ROS(·OH)含量相比进行配对t检验；对ROS(·OH)的含量与ECV304细胞增殖率的关系进行相关分析，结果用均数±标准差(x±s)表示，以P<0.05判定为差异有显著性。
2 结果
2.1 AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的影响 不同浓度的AngⅡ作用ECV304细胞4h时，细胞增殖不明显，与正常对照组相比差异无显著性(P>0.05)；作用时间为12h时，不同浓度AngⅡ(0.03125～1μmol/L)均可促细胞增殖，与正常对照组相比差异有显著性(P<0.05)，0.0625μmol/L AngⅡ促细胞增殖率达到最大，随AngⅡ浓度的增大，细胞增殖率反而逐渐减小；作用时间为24h时，细胞呈负增殖，随AngⅡ浓度的增大，增殖率逐渐降低。AngⅡ作用细胞12h时，与相同浓度组作用时间4h相比，细胞增殖率差异有显著性(P<0.05)，见表1。
表1 AngⅡ在不同时间对ECV304细胞增殖作用的影响 (x±s)
注：与正常对照组相比，P<0.05；与4h相同浓度组相比，*P<0.05
2.2 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用 与AngⅡ处理组相比细胞增殖率差异有显著性(P<0.01)，10mmol/L NAC可抑制1μmol/L AngⅡ对ECV304细胞的增殖作用，而与正常对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见表2。
表2 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用 (x±s)
注：AngⅡ处理组：AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组：1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC与AngⅡ处理组相比，**P<0.01
2.3 AngⅡ对ECV304细胞形态学变化的影响 正常对照组培养的ECV304细胞，4h后大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角，球形，少数细胞伸展，12h时，细胞逐渐生长呈梭形，有些细胞鱼贯状相连。0.0625μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12h后，可诱导细胞增殖，核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂象多见，胞浆丰富，内含小颗粒，细胞呈单层铺路石状排列。1μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12h后，核分裂象减少，部分细胞变圆，贴壁力减弱甚至消失。NAC干预组培养的ECV304细胞，核分裂象不明显，细胞生长与正常对照组相当。
2.4 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用 不同浓度的AngⅡ作用于ECV304细胞12h时，AngⅡ作用ECV304细胞产生·OH的含量与AngⅡ呈剂量和时间依赖性，随着浓度的增大和时间的延长，ECV304细胞的·OH含量逐渐增加，与正常对照组相比差异有显著性(P<0.05)。相同浓度AngⅡ作用12h与24h时·OH含量相比，差异有显著性(P<0.05)。NAC干预组与AngⅡ处理组的·OH含量相比，差异有显著性(P<0.05)，而与正常对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见表3、4。
表3 AngⅡ对ECV304细胞·OH含量的影响 (x±s)
注：与正常对照组相比，P<0.05；与24h相同浓度组相比，*P<0.05
表4 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用 (x±s)
注：AngⅡ处理组：AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组：1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC与AngⅡ处理组相比，P<0.05
2.5 ECV304细胞的·OH含量与细胞增殖率关系的评价 不同浓度AngⅡ(0.0625～1μmol/L)作用于ECV304细胞12h时，·OH的含量与细胞增殖率呈显著负相关(r=-0.800，P=0.000<0.01)，见图1。
图1 ECV304细胞·OH含量与细胞增殖率的相关性
3 讨论
血管内皮细胞发生氧化应激反应，在其特定的组织位点上氧化作用和抗氧化作用的平衡失调，蓄积产生ROS；AngⅡ被认为是血管氧化应激的主要诱导剂，可通过NADPH氧化还原酶诱导血管内皮细胞产生O2-，经自由基链反应，产生·OH［6，7］。新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时，可作为血管内皮信号转导分子，参与调节细胞功能［5］。
研究表明，AngⅡ可诱导血管平滑肌细胞产生内源性ROS引起细胞增殖，在心血管疾病的发生发展中具有重要作用［8］。但AngⅡ是否通过一定的氧化还原敏感信号转导途径促进血管内皮细胞增殖，以前的研究尚未证实。本实验结果发现：不同浓度的AngⅡ作用ECV304细胞4h时，细胞增殖不明显；作用时间为12h时，不同浓度AngⅡ(0.03125～1μmol/L)均可促细胞增殖，0.0625μmol/L AngⅡ促细胞增殖率达到最大，随AngⅡ浓度的增大，细胞增殖率反而逐渐减小；作用时间为24h时，细胞呈负增殖。在AngⅡ诱导血管内皮细胞增殖过程中，伴随有ROS(·OH)含量的变化，并且与内皮细胞的增殖率呈显著负相关。结果表明，AngⅡ是ECV304细胞氧化应激产生ROS(·OH)的诱导剂，可诱导ECV304细胞产生ROS(·OH)，ROS(·OH)含量与AngⅡ呈时间和剂量依赖性，一定量的ROS(·OH)有促进细胞增殖作用，随着ROS(·OH)含量的增多，细胞呈负增殖，提示ROS(·OH)在调控细胞增殖中起重要作用。
NAC常被用于研究自由基在体内外的生物化学作用。NAC对细胞具有抗氧化保护作用［9，10］。本研究结果发现，抗氧化剂NAC明显减少AngⅡ诱导的ECV304细胞产生的ROS(·OH)含量，并且明显抑制AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖。这提示ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖的主要信号转导分子之一。
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宫颈癌是我国也是本地区最常见恶性肿瘤，放射治疗是重要治疗手段，目前多采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用[1] 。
p27 基因是细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CDKI） 家族成员之一，是一类重要的细胞周期调控基因，可广泛抑制细胞周期素（ cyclin） 和细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK） 复合物的活性对细胞周期进行负性调控[2] 。Jean 等[3] 将p27 第187 位苏氨酸置换成丙氨酸（T187A） 转染HeyC2 细胞，发现细胞生长明显抑制，证实突变p27 （p27mt） 比野生型p27 抑制作用更强。p27mt对宫颈癌放疗作用如何未见有人报道，本文对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株和p27mt 由湖北医药学院临床研究所惠赠； Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。
1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。
1.2.4MTT法测定p27mt的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组p27mt基因终浓度参照文献[4] 确定为10、20，30，40，50MOL（感染复数）共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。
1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P
2 结果
2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。
2.2p27mt基因对Hela细胞增殖的影响 经不同浓度p27mt作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在6%-78%之间，与对照组比较，20MOLp27mt基因即可产生有统计学差异的抑制作用（P
2.3p27mt基因对Hela细胞的放射增敏作用 选取12Gy剂量射线加不同浓度p27mt基因作用于Hela细胞结果显示出细胞增殖抑制率可进一步随药物浓度的增加而升高，当浓度大于40MOL时曲线趋于平坦。药物加辐射后，其24h细胞增殖抑制率均较单纯辐射或单纯药物组有统计学差异（P
2.4细胞周期分析及凋亡检测 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果表明，与空白组比较，单纯放射或药物均能提高G2/M期细胞比例，诱导细胞出现凋亡（P
3讨论
重组腺病毒作为一种高效基因转移载体被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞，原因是腺病毒本身分子稳定，基因组不会发生重排，插入的外源基因也相当稳定，腺病毒允许插入的外源基因容量可达7.5Kb，不仅感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞，感染率几乎100 % 。另外，它不与宿主基因组整合，没有基因毒性，比较安全。因此本研究拟通过腺病毒将突变型p27基因和X射线联合作用宫颈癌Hela细胞株模型，通过检测其放射敏感性及细胞周期及凋亡的改变，探讨p27基因放射增敏的作用及机制，为在临床上将突变型p27做为宫颈癌放疗增敏剂提供理论依据。研究结果显示，单纯应用p27mt，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加。在此基础上，选用12Gy放射线联合不同浓度的p27mt做进一步的观察，结果显示，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用p27mt仍可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组（P
为初步探明增效机制，笔者进一步检测了p27mt同步放疗后对宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的影响，结果发现，单独p27mt、单独射线均能对细胞产生诱导凋亡和G2/M期阻滞的作用，而联合应用后作用效果更为显著，这说明p27基因可能通过阻滞细胞周期于对G2/M期达到放疗增敏的作用。
参考文献
[1]徐凤华，郭荣荣，孙华燕.吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的系统评价[J].中国循证医学杂志，2009，9（2）：218-229.
苍术（Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等［1］。
苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生《苍术油软胶囊的研制》。山东中医药大学硕士学位论文，2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞UMR-106的增殖作用。
1 材料与方法
1.1 材料
苍术药材购自上海德康药业有限公司,经中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。
1.2 试剂
DMEM 培养基(Cibco)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 挥发油样品的制备水蒸气蒸馏法：将药材样品粉碎过40目筛，精确称取200 g的苍术，加水浸泡1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取50 mg挥发油样品溶于1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的0.2 mm 滤器( Gelmann Sciences) 除菌,并于4℃保存，备用。临用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。
1.3.2 成骨样细胞UMR－106的培养［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤细胞系) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室,源于美国麻省医学院。将UMR-106细胞培养于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml链霉素）的无菌DMEM培养基中，置37℃,5%CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为5×106个/ml接种于100 ml培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育，2～3 d换液1次。
1.3.3 MTT 法测定细胞的增殖［2］取对数生长期细胞消化计数后,用含血清的DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1×105个/ml ,铺入96孔细胞培养板中(100 μl/孔)培养24 h后加入含不同浓度挥发油(每个浓度6孔)的无血清DMEM培养。结束培养4 h前弃去培养液,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml,用PBS配制)继续孵育4 h,有蓝紫色沉淀生成,每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO) ,振荡10 min待沉淀完全溶解,用酶标仪以550 nm 为测定波长、650 nm为参比波长测定吸光值,以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白,用t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下：
增殖率（%）= Ai实验组- Ao对照组Ao对照组×100%
Ai：不同条件下的吸光值；Ao：空白组的吸光值
2 结果
2.1 MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将UMR-106细胞分别以6个不同浓度(1×105～1.2×106个)铺入96 孔板,培养8 h贴壁后,用上述方法测定每孔吸光度(Y),与细胞数目(X)作线性回归,得标准曲线方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0,n=6),两者具有良好的线性关系。见图1。
2.2 挥发油对细胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4种浓度的挥发油作用于细胞24 h，在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表1 。表1 不同挥发油浓度对UMR-106的增殖作用(略)
苍术挥发油浓度0.001 mg/ml时培养24 h，可明显促进细胞的增殖,细胞的增殖率为10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用,表明挥发油短期内使用低浓度较好。
为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间,用浓度为0.001 mg/ml的苍术挥发油作用于细胞分别为24，48，72 h , 在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表2。表2 不同作用时间对细胞增殖的影响(略)
由表2可见，当挥发油在浓度为0.001 mg/ml作用24 h时能明显刺激UMR-106增殖，在近48 h时增殖率为20.96％， 达到最强,72 h 时细胞数目又下降。
3 讨论
苍术挥发油在0.001 mg/ml浓度下作用24，48 h，均对UMR-106增殖有明显的促进作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤细胞系从形态和性质上都保留了成骨细胞独有的特征, 并且具有稳定、均一、纯度高等优点。 因此,UMR-106 细胞作为一种国际公认的成骨细胞系可以用来代替成骨细胞［3］。在骨形成最初阶段的成骨细胞增殖期, 成骨细胞数量增多, 形成多层细胞并合成、分泌I型胶原以便最终矿化形成骨结节。成骨样细胞的增殖与细胞培养液中药物的成分有关, 与成骨样细胞UMR-106共同体外培养的方法可能作为对骨形成有促进作用的活性化合物的筛选模型, 经过进一步的动物体内实验从这些活性药物中追踪对骨形成有促进作用的活性成分。因此，以成骨样细胞UMR-106 的增殖为活性指标,观察了苍术挥发油对该细胞系增殖的作用。由于采用的是苍术挥发油和细胞共同体外培养的方法,推测苍术挥发油中含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分,为苍术治疗骨质疏松症提供初步筛选，具体机制有待进一步研究。
