单倍体的和卵细胞通过受精作用可以恢复为二倍体。减数分裂过程中四分体中的非姐妹染色单体的部分片段发生交换、非同源染色体自由组合，使得配子的遗传多样化，增加了后代的适应性，因此减数分裂不仅是保证生物种染色体数目稳定的机制，同且也是物种适应环境变化不断进化的机制。
有丝分裂和减数分裂既有区别又有联系，怎样使学生在这里既能把握联系又能区分不同呢？结合课堂教学实践，应该从以下方面入手：
1 如何快速根据图像判定有丝分裂和减数分裂的时期
1.1 根据染色体行为判断细胞分裂时期
首先，如果发现染色体无规律分布，则为前期。
其次，如果发现染色体排列在中央，则为中期。
最后，如果发现染色体移向两极，则为后期。
1.2 根据染色体数目判断细胞分裂方式
首先看染色体的数目：奇数的话一定是减数第二次分裂（但是减数第二次分裂期染色体数目不一定为奇数），否则可能是有丝分裂或者减数第一次分裂。
其次看有无同源染色体：有的话一定不是减数第二次分裂。
最后如果有同源染色体，看同源染色体的行为。如果有联会、四分体存在则一定是减数第一次分裂。反之则为有丝分裂。
2 有丝分裂和减数分裂的理论区别
首先，减数分裂过程中细胞连续分裂两次，而有丝分裂过程中细胞只分裂一次。
其次，减数分裂的结果是染色体数目减半，而有丝分裂的结果是染色体数目不变。
再次，减数分裂后，一个细胞变为四个含有不同遗传物质组合的子细胞（考虑四分体中非姐妹染色单体片段交换）。或者两两相同的子细胞（不考虑单体片段交换）。而有丝分裂后，一个细胞只形成两个遗传物质相同的子细胞。
第四，减数分裂过程中有其特有的同源染色体配对和同源非姐妹染色单体间的局部交换，而有丝分裂则没有。
最后，减数分裂发生部位为或者精巢和卵巢，有丝分裂发生部位为体细胞（但是原始生殖细胞即性原细胞发生增殖时属于有丝分裂）。
3 有丝分裂和减数分裂的生物学意义区别
3.1 有丝分裂的生物学意义：细胞有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的染色体经过复制以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。有丝分裂的目的是细胞增殖，即细胞数量的增加。对于单细胞生物体，细胞分裂意味着生物个体数的增加。多细胞生物体的生殖活动也是通过细胞分裂完成的。对于多细胞生物体，细胞分裂则是生物体生长发育的基础。细胞分裂保证了细胞有足够大的表面积与环境进行物质交换，从而保证了新陈代谢对物质更新的需求。因此细胞分裂是生物体生长、发育和繁殖的基础。
3.2 减数分裂的生物学意义：减数分裂是遗传学的基础。其目的是产生成熟的生殖细胞。具体表现在：
3.2.1 基因分离律的细胞学基础：在减第一次分裂过程中，因为同源染色体分离，分别进入不同的子细胞，故在子细胞中只具有每对同源染色体中的一条染色体。减数分裂中同源染色体的分离，正是基因分离律的细胞学基础。
3.2.2 基因连锁和互换的细胞学基础：同源染色体联会时，非姐妹染色单体之间对称的位置上可能发生片段交换，也就是父源和母源染色体之间发生遗传物质的交换。这种交换可使染色体上连锁在一起的基因发生重组，这就是染色体上基因连锁和互换的细胞学基础。
3.2.3 配子的遗传基础多样化：由于减数分裂，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中非同源染色体重新组合，同源染色体间发生部分交换，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境条件的变化有更大的适应性。
4 有丝分裂和减数分裂的种类区别
4.1 有丝分裂的类型：出现纺锤丝的细胞分裂均可看作是有丝分裂。所以减数分裂也是一种特殊的有丝分裂。
4.2 减数分裂可分为三种主要类型
4.2.1 配子减数分裂：配子减数分裂，也叫终端减数分裂，其特点是减数分裂和配子的发生紧密联系在一起。在雄性脊椎动物中，一个精原细胞变为初级精母细胞后减数分裂为2个次级精母细胞，2个次级精母细胞又一次进行减数分裂，总共形成4个精细胞。精细胞在经过一系列的变态发育，形成成熟的。在雌性脊椎动物中，一个卵母细胞经过减数分裂形成1个极体和1个次级卵细胞，次级卵细胞再分裂形成一个卵细胞和一个极体，极体也分裂为两个极体，总共形成一个卵细胞和三个极体。
4.2.2 孢子减数分裂：孢子减数分裂，也叫中间减数分裂，（居间减数分裂）见于植物和某些藻类。其特点是减数分裂和配子发生没有直接的关系，减数分裂的结果是形成单倍体的配子体（小孢子和大孢子）。小孢子再经过两次有丝分裂形成包含一个营养核和两个雄配子（）的成熟花粉（雄配子体），大孢子经过三次有丝分裂形成胚囊（雌配子体），内含一个卵核、两个极核、3个反足细胞和两个助细胞。
4.2.3 合子减数分裂：合子减数分裂，也叫初始减数分裂，仅见于真菌和某些原核生物，减数分裂发生于合子形成之后，形成单倍体的孢子，孢子通过有丝分裂产生新的单倍体后代。此外某些生物还具有体细胞减数分裂现象，如在蚊子幼虫的肠道中，有一些由核内有丝分裂形成的多倍体细胞，在蛹期又通过减数分裂降低了染色体倍性，增加了细胞数目。减数分裂由紧密连接的两次分裂构成。通常减数第一次分裂分离的是同源染色体，所以称为异型分裂或减数分裂。减数第二次分裂分离的是姊妹染色体，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂或均等分裂。
5 有丝分裂和减数分裂的相同点及联系
5.1 DNA分子的数量计算都相同：其一，有染色单体时，DNA数等于染色单体数。其二，无染色单体时，DNA数等于染色体数。
5.2 染色体数的计算都相同：染色体数等于着丝点数。
0 引言
乳腺癌的化学治疗近年来有了长足的进展，然而，经多线治疗仍复发转移的晚期患者的治疗，仍然十分棘手。探索包括生物靶向治疗在内的新疗法已成为近年研究的热点之一。
本研究室的前期研究表明，以HER2 mRNA为靶点的特异性硫代反义寡核苷酸，可以抑制HER2过表达乳腺癌细胞株增殖活性[1]。本研究拟对既往合成的反义寡核苷酸HA6722 单用或与紫杉醇联用时的抗乳腺癌活性进行研究，试图探索乳腺癌治疗新方法。
1 材料与方法
1.1 细胞系及培养
本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco， BRL），内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco， BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。当细胞生长至80%～85%融合时用0.25%胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。
1.2 硫代反义寡核苷酸的合成及体外脂质体转染
反义寡核苷酸的靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722序列为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，其命名原则及合成见文献报道[2]。全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：HA6722：5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′
琼脂糖凝胶电泳结果表明反义寡核苷酸纯度符合要求。反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解浓度为50μmol·L-1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。
反义寡核苷酸体外脂质体转染按Invitrogen， Gibco BRL公司脂质体转染说明书所述方法进行。当培养细胞达到65%～70%融合时，进行转染，具体方法见文献[3]。
1.3 紫杉醇 由海南海药公司提供，30mg/支，临用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。
1.4 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法检测细胞活度 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar，USA），接种数量分别为：MDAMB453 5×104/孔、 MDAMB231 2×104孔。实验组及对照组细胞培养均设三个平行孔。待细胞生长至65%～70%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722转染细胞4～6h，再加入同摩尔浓度的紫杉醇，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO， 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。
1.5 细胞凋亡（apoptosis）检测 凋亡试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。以100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理MDAMB453细胞12h，以及用50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453乳腺癌细胞6h，收集经紫杉醇及HA6722单药或联合作用后的MDAMB453乳腺癌细胞，离心涂片，按操作说明检测细胞凋亡。细胞核内出现棕褐色沉淀为阳性，反之为阴性。凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/计数总细胞数）×100%。
1.6 反义药物及紫杉醇的疗效评价
对数生长期的MDAMB453细胞及MDAMB231细胞经系列浓度的HA6722及紫杉醇单用或联合作用后， MTT法测定OD值。紫杉醇单用时的系列终浓度为1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1，而HA6722单用时的系列终浓度为12.8，32，80，200，500，1 250nmol·L-1；联合应用时二者以等摩尔浓度混合，系列浓度依次为6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1，反应终体积为200μl。生存分数f按下述公式计算：f=ODtreat/ODcontrol(1)
联合方案的疗效评价按有关文献进行[4，5]，即以log(1/f1)对log（药物浓度）作图，并行线性拟合，得曲线的x轴截距即为log（IC50），和直线斜率m，利用下述公式计算产生效应f时的单药及联合时的药物浓度：Dosef=DoseIC50[(1/f)1]1/m (2)
由于联合方案采用的是固定摩尔浓度比，因此产生效应f的药物浓度可分解为联合药物的浓度（D）1和（D）2，对于产生任一效应f时的药物联合指数(combine index，CI)可以下列公式算出：
CI＝（D）1（Df）1＋（D）2（Df）2＋α（D）1（D）2（Df）1（Df）2(3)
式中（D）1和（D）2分别代表联合用药产生效应f时的浓度，而（Df）1和（Df）2分别代表药物单用时产生效应f时的浓度；根据推测两药不排斥或相互排斥的可能，α取值1或0；CI反映二药联合的相互作用，大于1表示拮抗，等于1表示相加，小于1表示协同。全部试验均进行3次以上重复。
1.7 统计学处理
采用SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理，实验数据以±s表示，均数比较采用Student’s t检验和方差分析F检验（One Way Anova）。
2 结果
2.1 HA6722及紫杉醇单用时对两种乳腺癌细胞的抑制作用
在1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1的终浓度下，紫杉醇对两种乳腺癌细胞的生长均显示剂量依赖性抑制作用，其抑制的IC50值分别为19.4±4.1nmol·L-1及23.6±5.7nmol·L-1，见图1A；而在12.8、32、80、200、500、1 250nmol·L-1的系列浓度作用下，HA6722对两种不同HER2表达水平的乳腺癌细胞的体外生长的影响迥然不同，对HER2过表达的MDAMB453细胞呈现明显的剂量依赖性抑制，而对HER2低表达的MDAMB231细胞则几乎没有抑制， IC50分别为47.6±7.9nmol·L-1和731.8±14.3nmol·L-1(n=3，P＜0.01，见图1B。
2.2 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDAMB453乳腺癌细胞的抑制作用
从上述初步结果可以看到，12.8nmol·L-1浓度的HA6722对MDAMB453细胞的抑制率只有4.7%，因而该浓度被作为非治疗浓度用于增强紫杉醇的药理作用研究，结果表明，由于该浓度HA6722的加入，紫杉醇对MDAMB453细胞的抑制作用增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n= 3，P＜0.05）。
等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用的研究表明，经6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1的两种药物共同作用，MDAMB453细胞增殖呈现更为明显的抑制，见图2 A、B、C。在IC50浓度下的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，在研究涉及的全部药物浓度范围内，两种药物的联合指数波动在（0.85±0.11）～（0.87±0.27）之间，见图2D。
转贴于
为了澄清HA6722与紫杉醇协同抗肿瘤作用是否具有细胞选择性，对HER2低表达的乳腺癌细胞株MDAMB231细胞也进行了同样的研究，结果表明，等摩尔浓度的二种药物合用对该细胞株的联合指数在所检测的药物浓度下，波动在（1.13±0.21）～（1.19±0.24）之间，见图3。
2.3 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDAMB453乳腺癌细胞凋亡的影响
经100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理或以50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453细胞后，TUNEL法对细胞凋亡的检测显示，HA6722与紫杉醇合用增强了细胞的凋亡作用（n=3，P＜0.05），见表1。
3 讨论
业已证明，原癌基因HER2过表达是一个独立的、不良的预后指标，将导致乳腺癌患者对某些化疗方案耐药[6]，生存期缩短[7]。
图1 紫杉醇及反义寡核苷酸HA6722单用时对两种乳腺癌细胞株，MDAMB453及MDAMB231细胞体外增殖的影响（略）
图3 等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用时对MDAMB231联合指数随生存分数的变化曲线（略）
图2 紫杉醇和HA6722单用或联合时对MDAMB453细胞增殖的影响（略）
表1 HA6722与紫杉醇单用或联合应用对MDAMB453细胞凋亡的影响（略）
MDAMB453组*P
紫杉醇是一种新型的抗微管集聚剂，是当前乳腺癌治疗中疗效较高的药物之一。然而，由于绝大部分细胞毒药物存在剂量限制性毒副作用（DLTs），因而单用化疗药物不但无法治愈肿瘤，而且还会产生严重的毒副作用。事实上，一度被认为乳腺癌根治希望所在的大剂量化疗（HDCT）加干细胞支持疗法也并没有达到根治甚至是有效改善乳腺癌患者预后的目的[8]。
生物靶向治疗近年逐渐成为研究的焦点，以bcl2等基因为靶点的反义药物G3139已在体外及体内研究中均显示出明确的抗肿瘤作用，并可增强细胞毒药物的抗肿瘤效果[9，10]。如采用反义药物与细胞毒药物联合的办法，能在不影响抗肿瘤效果的前提下，降低细胞毒药物的用量，减少或避免毒性反应的发生，不失为一种两全的策略。本研究对反义药物HA6722与细胞毒药物紫杉醇对乳腺癌细胞体外增殖进行了相关研究。结果表明， 以低剂量（非治疗剂量）的HA6722与紫杉醇联合，可以引起紫杉醇抗MDAMB453细胞增殖活性的明显增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n=3，P＜0.05）；而等摩尔浓度的上述两种药物联合，其对MDAMB453细胞的抗增殖作用较之两倍浓度的单药作用更强。在IC50浓度下两药的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，表明二者合用对HER2过表达的MDAMB453细胞的抑制作用是协同的。
本研究对两种药物合用时对乳腺癌细胞的凋亡过程进行了观察。结果表明，合用时MDAMB453细胞凋亡率明显强于二药之一的单独应用，与文献报告一致[11，12]。
本研究尚对另外一种HER2正常表达细胞MDAMB231细胞进行了研究，结果表明，HA6722和紫杉醇合用并未引起抗肿瘤活性的增强，进一步说明，这两种药物的协同抗肿瘤作用，是以乳腺癌细胞的HER2基因乃至受体过表达为前提，其详细机制有待于进一步研究。
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1.在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异。细胞的这种特化不仅是正常发育所必需的,而且还能提高细胞各种生理功能的效率。
2.一般说来,体内各种细胞均含有物种的全部基因,但基因的表达具有时空性。细胞之所以在形态、结构和功能上发生稳定性差异,是因为组织特异性基因选择表达成了组织特异性蛋白的缘故。从理论上讲,已分化的细胞仍然具有发育成一个完整个体的潜能。
3.细胞分化是渐进性的,其方向的限定早于形态差异的出现,且分化细胞的表型保持相对稳定,一般不可逆转。
之所以采用完整的陈述句的形式来表述概念,是因为这种表述方式更易于确认需要学生理解和掌握概念的内容及意义,也更易于建立概念之间的联系。
二、“细胞分化”概念教学的组织
在分析“细胞分化”的概念内涵及层级之后,教学设计应该紧紧围绕着相应的概念条款展开,通过列举事实、分析讨论,或者基于资料的探究等活动,帮助学生深层理解这些概念内涵,并基于概念理解而构建合理的知识结构(见图1)。
1.列举事实,尝试定义。呈现人的受精卵发育至胎儿的图片:列举学生熟知的根尖分生区细胞分化成伸长区、成熟区的事实,然后,引导学生抽象概括出:“细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异的过程。”这是广大教师一贯坚持的做法,值得肯定。因为事实是用来帮助学生建立和理解概念的,事实当然要围绕着概念的结构来排布。但是,定义常常不等同于概念。“定义”通常用“是……”来表述,说得十分肯定。“概念”描述一类事物的本质,有时并不用“是”来描述。在引导学生下定义之后,教师还应该设置下列问题,吸引学生深入思考细胞分化的结果和生物学意义。①在人的个体发育过程中,假若没有细胞分化,受精卵能发育成胎儿吗?为什么?②细胞在形态、结构上出现特化,对于细胞完成其生理功能有何意义?③从遗传的角度分析,受精卵为什么能够发育成一个完整个体?问题3的设置实际上是指向“细胞全能性”这一核心概念的丰富内涵,之所以在此设置问题3,一方面是因为不仅已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能,未分化的受精卵在自然条件下更容易发育成一个完整的个体。也就是说,“细胞全能性”这一概念是随着教学进程不断建构起来的;另一方面,其用意还在于探讨细胞分化的原因,起到承上启下的教学功效。
2.探究发现,明晰原因。美国地平线研究组(Horizon Research Team)主席维斯(Weiss)及高级研究助理帕斯利(Pasley)经过了18个月的观察,对364节课详细分析,发现优质课堂主要有几个特征,其中包括:①在课堂教学过程中,教师善用多种策略,为某个科学概念提供清晰的阐释;②吸引学生从事动脑筋的活动;③帮助学生理解学科的核心概念等。因此,可以引入相关科学史对细胞分化原因进行探讨。
资料1:最早试图对细胞分化机制作出解释的学者是Weismann(1883),他根据当时对马蛔虫的研究结果,提出了“体细胞分化是由于遗传物质丢失造成的,每一种组织只保留了其特有的遗传物质”的见解。在马蛔虫这一特例中,在卵裂过程中体细胞的染色体确实发生丢失现象。因此,Weismann这一观点在当时看来既符合逻辑,又有实际例证,因而被学术界所普遍接受。你同意上述观点吗?根据是什么?
资料2:1958年Steward等利用胡萝卜根的韧皮部组织培养出了完整的新植株;1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株。
资料3:1969年Nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。
分析资料2和资料3,你得出的结论是什么?基于对上述3则资料的分析探究,学生就容易得出以下结论:①高度分化的植物体细胞,遗传物质并没有丢失,仍含有发育成一个完整个体所需的全套基因,具有发育的全能性;②在二倍体染色体组中,只要有一套单倍体的基因组,就含有该物种的全部遗传信息,因此,植物的生殖细胞也具有发育的全能性。至此,细胞全能性的概念内涵已昭然若揭,师生共同归纳(见图2)。学生仍然会有2个疑问:①既然已分化细胞中含有相同的遗传信息,为什么细胞的形态、结构和生理功能会出现稳定性差异?②已分化的动物细胞是否也像植物细胞那样具有发育的全能性?针对疑问1,教师可以列举事实,循循善诱,问题指向要明确,最终让学生领悟“细胞分化是组织特异性基因表达的结果”。例如:通过分子杂交实验表明,在任何时间一种细胞的基因组只有一少部分基因在活动。在幼红细胞中,糖酵解酶系的编码基因、核糖体蛋白基因是否均能表达?血红蛋白基因、胰岛素基因是否都能表达?细胞的形态、结构与生理功能主要由哪种化学物质直接体现?幼红细胞最终分化成红细胞的主要原因是什么?针对疑问2,教师要向学生说明:到目前为止,人们还没有成功地将单个已分化的动物体细胞培养成新个体,这是因为动物细胞的发育潜能随着分化程度的提高而逐渐变窄。但这种分化潜能的变化是对细胞整体而言的,对细胞核来说是否还保持着全能性呢?进而引导学生分析细胞核移植实验。
3.因果分析,把握特征。学生一旦理解了细胞分化的因果关系,就容易从中把握细胞分化的特征:①渐变性——细胞在发生形态差异之前的一定时间,细胞分化命运即已确定,基因活动模式已发生改变,从基因到蛋白质再到细胞形态、结构、功能特化是一个渐变过程。②不可逆性——分化细胞的表型保持相对稳定,以执行特
effects of allicin or allicin with cisplatin on growth of endometrial carcinoma in ishikawa cells in vitro
jia li-gang,wang hui-lan,tian li.the people’s hospital of hebei,shijiazhuang 050051,china
［abstract］ objective to study the effects of allicin or allicin with cisplatin on human endometrial carcinoma ishikawa cell line.methods human endometrial carcinoma ishikawa cells were treated with allicin or allicin with cisplatin.cell growth rate was determined with mtt assay.flow cytometry was used to examine cell cycle and apoptotic rate of cells.the expression of bcl-2 was measured by immunohistochemical and t by trap assay.results allicin （12.5～50 mg/l） inhibited proliferation in human endometrial carcinoma ishikawa cells in time-dependent and dose-dependent manner.ishikawa cells were arrested at g2/m phase and resulted in apoptosis by allicin.telomerase activity and the expression of bcl-2 was down-regulated after allicin treatment when it induced apoptosis.the effects of allicin group was lower than that of allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） in corresponding concentration and took a manner in time-dependent and dose-dependent.conclusion allicin could inhibit the proliferation and enhance apoptosis in endometrial carcinoma cell line ishikawa in vitro.allicin cooperated with cisplatin at influencing the proliferation of ishikawa cells.the ability of inhibiting the proliferation and enhancing apoptosis in allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） group was stronger than that of allicin group.allicin induced apoptosis has associated with telomerase.bcl-2 was involved in the regulation of telomerase activity.the ability of it in allicin combined with cisplatin（1.0 mg/l） group was strong than that of allicin group.the mechamisms of allicin combined with cisplatin will provide theoretical basis for endometrial carcinoma treatments with less chemotherapeutic drug.
［key words］ allicin；cisplatin；ishikawa cell；apoptosis；telomerase；bcl-2
子宫内膜癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一。对于那些不能手术或术后复发的子宫内膜癌患者，可给予化疗。然而在化疗过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常增殖细胞也有杀伤作用，因而影响化疗的疗效。而且化疗药物都有较严重的副反应，患者治疗的依从性差，生活质量明显降低。所以如何使药物对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞的毒性减少到最低的化疗方案成为人们关注的焦点之一。本研究旨在通过细胞培育探讨大蒜素及与顺铂联用对子宫内膜癌ishikawa细胞生长的影响，从而为临床减少化疗药物的应用提供充分的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验对象 高分化子宫内膜腺癌细胞（ishikawa细胞系）：购自美国atcc细胞库。
1.1.2 药物与试剂 大蒜素为安徽安达产品有限公司惠赠。顺铂为中国齐鲁制药厂产品。鼠抗人bcl-2单克隆抗体，北京中山生物公司产品。telomerase-pcr-elisa检测试剂盒为boehringer manheim公司。
1.1.3 主要仪器 芬兰labsystems dragon well scan mn3型酶标仪。流式细胞仪（beckman coulter epics xlusa）。5% co2无菌恒温培养箱heraeus bb5060/bb16（上海）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培育 人子宫内膜癌ishikawa细胞用rpmi-1 640培养液（含青霉素浓度为100 iu/ml,链霉素浓度为100 μg/ml,10%胎牛血清，ph值7.2），于37 ℃、5% co2饱和湿度培养箱内松盖培育。
1.2.2 mtt检测 取对数生长的ishikawa细胞，制成浓度为7×104个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔100 μl，贴壁后，换培养液，实验组分为大蒜素组、顺铂组和大蒜素+顺铂组，大蒜素组（由吐温80溶解）分别加入含大蒜素为12.5、25、50 mg/l的培养液（各组含0.01%吐温80）；顺铂组加入含顺铂为1.0 mg/l的培养液；大蒜素+顺铂组加入含各浓度大蒜素和顺铂（1.0 mg/l）的培养液，对照组为含0.01%吐温80的培养液。每一浓度均设6个平行孔。每个实验均重复3次。继续培养24、48、72 h后，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的mtt溶液，继续孵育4 h。吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜200 μl，振荡8～10 min,用酶标光度仪在波长为492 nm时测定每孔的吸光度（a）值,并计算抑制率，抑制率=（对照组a值-实验组a值/对照组a值）×100%。
1.2.3 细胞周期和细胞凋亡的检测 将浓度为7×104个/ml接种于100 ml培养瓶中。贴壁后加入上述大蒜素组和大蒜素+顺铂组培养液。对照组加入含0.01%吐温80的培养液。继续培养72 h，用胰酶消化后收集细胞，用70%的冷乙醇固定，用pi（50 μg/ml）1 ml避光染色后,置流式细胞仪（flow cytometer,fcm）分析。
1.2.4 ishikawa细胞端粒酶活性测定 （1）取1×105个ishikawa细胞行裂解、端粒酶的提取，移取上清液。（2）端粒重复序列扩增反应（trap）：参照说明书。取20 μg细胞提取物，反应总体积为50 μl。pcr仪行产物扩增；引物延长，一个循环；端粒酶灭活，一个循环；端粒酶扩增30个循环；72 ℃平衡10 min,4 ℃保存。（3）杂交及酶联免疫吸附反应（elisa），30 min内于酶标仪上测定在波长450 nm/690 nm处的吸光度a值，根据δa=a450-a690计算。
1.2.5 ishikawa细胞株bcl-2测定 取浓度为7×104个/ml的ishikawa细胞，以链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin/peroxidase,sp）法测定ishikawa细胞bcl-2抗体。在6孔板中预先放置盖玻片，将细胞悬液滴在盖玻片上，爬片后加入各浓度实验组培养液。对照组加入含0.01%吐温80的培养液。结果判定采用组织化学评分（h-score）法：每一浓度2张玻片，每片至少观察5个视野，阳性染色为细胞核内出现棕黄色颗粒，以代表染色深浅，共0～3分：0分为不着色;1分为着色浅，呈浅黄色；2分为中度着色，呈深黄色；3分为着色深，呈棕色/咖啡色。pi代表每一着色程度的细胞所占的比例，为0～100%，h-score=∑pi（i±1），满分为4分。
1.3 统计学方法 细胞吸光度值（a）和bcl-2表达用均数±标准差（±s）表达，多组间比较，采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用sas软件包进行统计。p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大蒜素、顺铂和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞增殖的影响 本实验结果显示，当顺铂浓度为1.0 mg/l时，对ishikawa细胞生长有轻度抑制作用，但与对照组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。即顺铂在该浓度时对细胞生长无影响，见表1。
而大蒜素和大蒜素+顺铂组均对细胞有明显的抑制作用（p＜0.01）,且在两组内随着时间和浓度的增加，增殖抑制率升高，增殖抑制率与时间和浓度之间具有显著正相关性（p＜0.01）。各浓度的大蒜素单独作用后的细胞抑制率低于与之相对应的大蒜素和顺铂联合作用下的增殖抑制率，两者相比，差异有统计学意义（p＜0.01），见表2。
2.2 大蒜素和大蒜素+顺铂对ishikawa细胞的生长周期和凋亡率的影响 经fcm检测发现，ishikawa细胞周期分布和凋亡率发生改变。大蒜素组（12.5～50 mg/l）g2/m期细胞含量分别为（9±1.1）%、（28±0.6）%、（40±2.6）%，凋亡率为分别为（5.41±1.39）%、（7.38±2.08）%、（18.46±1.47）%；大蒜素（12.5～50 mg/l）+顺铂（1 mg/l）组g2/m期细胞含量分别为（18±1.6）%、（39±2.2）%、（56±4.6）%，凋亡率为分别为（15.17±2.63）%、（28.67±2.19）%、（43.07±1.12）%。与对照组相比，两组g2/m期细胞含量比例上升，凋亡率亦上升。大蒜素联合顺铂组较单独使用大蒜素组，其g2/m期细胞含量和凋亡率明显升高（p＜0.01），且各组内差异亦有显著统计学意义（p＜0.01），并在g1峰前出现细胞凋亡峰。
2.3 ishikawa细胞端粒酶活性的表达 经不同浓度的大蒜素处理24、48、72 h后，细胞中端粒酶的活性呈现出随时间和浓度增加而降低的趋势，而大蒜素联合顺铂组细胞中端粒酶活性的降低较单纯使用大蒜素更明显，且与对照组比较，其差异有显著统计学意义（p＜0.01），见表3。
2.4 ishikawa细胞bcl-2的表达 ishikawa细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色，经不同浓度的大蒜素处理24、48、72 h后，细胞中bcl-2的含量呈现出随时间和浓度增加而降低的趋势，而大蒜素联合顺铂组细胞中bcl-2的含量降低较单纯使用大蒜素更明显，两者相比差异有显著性意义（p＜0.01），且各组内差异亦有显著性意义（p＜0.01），见表4。表1 作用48 h对照组与顺铂组的细胞吸光度值表2 不同时间大蒜素组和大蒜素+顺铂组的细胞相对抑制率表3 不同时间大蒜素和大蒜素+顺铂组对细胞端粒酶活性的影响 表4 不同时间大蒜素及联合组对细胞bcl-2含量的影响 注：各浓度组比较p<0.01；各时间组比较，p＜0.01
3 讨论
大蒜是百合科葱属植物的鳞茎，主要的生物活性物质是其特有的含硫化合物，其具有降低肿瘤的危险性和抗肿瘤的生物学作用，而无明显的不良反应；而顺铂是目前应用最广泛的抗肿瘤药物，但其水溶性差、口服活性低、缓解期短、毒副作用较强，大剂量或连续用药可致严重而持久的肾毒性、听觉衰退等现象。故大蒜和顺铂联用能否既减少化疗药物的应用，减轻不良反应，又能够达到同样甚至更强的治疗效果，是本研究的主要目的。
3.1 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖的影响 本实验中，单纯应用大蒜素于人子宫内膜癌ishikawa细胞，所用剂量分别为12.5、25、50 mg/l。药物作用24、48、72 h后，经mtt检测所得抑制率与对照组比较，随着药物浓度和作用时间的增加，抑制率明显增高。表现为时间和剂量依赖关系。而顺铂作为治疗肿瘤的首选药物，其疗效是肯定的。本实验采用较低剂量的顺铂作用于人子宫内膜癌ishikawa细胞，浓度分别为1、2.5、5.0 mg/l，作用72 h后抑制率分别为（1.96±0.127）%、（19.02±0.189）%、（37.86±0.162）%。而当顺铂浓度为1 mg/l时，其抑制率与对照组无统计学意义。表明顺铂为该浓度时对细胞无影响。本实验研究发现，若将1 mg/l的顺铂分别与不同浓度的大蒜素联合应用，药物作用24、48、72 h后，所得抑制率较对应的大蒜素组明显提高，表现为时间和剂量依赖关系。因而可大胆设想，在化疗药物无治疗作用的浓度时，加用大蒜素，对化疗药物有增敏作用，较单独应用大蒜素对肿瘤细胞的抑制更明显。
3.2 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响 目前，有学者认为肿瘤是一类细胞周期疾病。他们认为许多癌基因、抑癌基因直接参与了细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控的主要成分，他们突变的结果，导致细胞周期的失控，包括细胞周期启动、运行和终止的异常，使细胞获得以增殖过多、凋亡过少为主要形式的失控性生长特征。细胞周期存在着g1/s转换和g2/m转换两个重要的控制位点。而细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。它是由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细胞死亡。miron等［1］研究发现，大蒜素能抑制hl60和u937细胞的生长并诱导其凋亡。seki等［2］报道，大蒜素诱导人类结肠癌细胞（hct-15和dld-1）的凋亡，并将细胞周期阻滞于g2/m期，且呈时间和剂量依赖关系。本研究采用fcm及细胞形态学检测手段观察了大蒜素单独和联合顺铂对子宫内膜癌ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响。透射电镜下可见到凋亡小体。fcm分析发现，大蒜素作用24、48、72 h后，细胞凋亡率和g2/m期细胞比例上升，其差异有显著统计学意义（p＜0.01）；而大蒜素联合顺铂组其细胞凋亡率和g2/m期细胞比例较单纯大蒜素组上升更明显，且出现亚二倍体峰即细胞凋亡峰，呈时间和剂量依赖关系。在透射电镜下可见到凋亡小体。由此推断大蒜素单独和联合顺铂将ishikawa细胞阻滞于g2/m期，诱导细胞凋亡，从而控制了肿瘤细胞的增生。
3.3 大蒜素单独和联合顺铂应用对子宫内膜癌ishikawa细胞端粒酶活性和bcl-2表达的影响 端粒酶由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（rnp）,含有端粒重复序列的模板，即以自身rna组分为模版，复制合成端粒序列。正常细胞周期中，细胞每分裂一次，端粒子链即缩短一次，经过若干分裂周期后，端粒缩短到临界长度时，细胞进入凋亡，端粒酶检测为阴性。因此端粒的缩短限制了细胞增殖能力。而癌细胞则是在某些机制作用下，启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定的维持在一定长度，从而使癌细胞得以持续增殖，并获得永生化［3］，此时端粒酶检测阳性。有研究表明，人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶活性的表达［4］。
端粒酶rna（htr）是端粒酶的重要组分之一。mese等［5］的研究表明端粒是顺铂发挥作用的靶点。顺铂作为dna损伤剂，其同dna的连接方式主要为g-p1-g和a-p1-g的形式，而端粒酶和端粒酶htr的碱基顺序正是富含这种结构。因而顺铂抑制了htr的表达，从而对端粒酶活性进行了调节。
本实验结果显示，大蒜素能够诱导细胞凋亡（阻滞于g2/m期），其原因可能和端粒酶活性下降有关。端粒酶活性下降后，端粒缩短，细胞有丝分裂受阻，导致细胞凋亡。sharma等［6］研究发现凋亡抑制基因bcl-2能够调节端粒酶活性，当bcl-2过量表达时，端粒酶活性增强；当bcl-2表达量下降后，端粒酶活性也下降。filomeni等［7］研究发现，大蒜素能够下调bcl-2的表达。xiao等［8］研究发现,dats能诱导人类前列腺癌细胞pc-3和du145的凋亡，其机制是通过c-jun氨基末端激酶（c-jun n-terminal kinase，jnk）和erk（extracellular signal-regulated kinase）信号通路介导的bcl-2磷酸化，bcl-2磷酸化后使得它抑制凋亡的功能丧失，受损的靶细胞发生凋亡。
本研究结果显示大蒜素及联合组在诱导ishikawa细胞凋亡的同时，端粒酶活性受抑制，bcl-2的表达下降，而且呈时间依赖性和剂量依赖性。联合组较与之相对应的各浓度大蒜素组抑制更明显。提示大蒜素在体外诱导凋亡的同时伴随bcl-2表达水平的下调及端粒酶活性的下降，表明大蒜素诱导ishikawa细胞凋亡的调控与细胞端粒酶表达之间存在密切联系，bcl-2可能是联系细胞凋亡和端粒酶调节之间的重要纽带。本实验显示大蒜素联合顺铂与单独应用大蒜素相比，大蒜素可增强顺铂对端粒酶活性的抑制作用，促进细胞的凋亡率。从而为临床上联合应用大蒜素，减少化疗药物的使用及其不良反应，而达到同样甚至更好的治疗效果提供理论依据。
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2 seki t,hosono t,hosono fukao t,et al.anticancer effects of diallyl trisulfide derived from garlic.asia pac j clin nutr,2008,17（1）:249-252.
3 chakraborty s,ghosh u,bhattacharyya np.inhibition of telomerase activity and induction of apoptosis by curcumin in k-562 cells.mutat res，2006，27.
4 kim nw,piatyszek ma,prowse k,et al.specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.science,1994,266:2011.
5 mese h,ueyama y,suzuki a.inhibition of telomerase activity as a measure of tumor cell killing by cisplatin in squamous cell carcinoma cell line.chemotherapy,2001,47（2）:136-142.
6 sharma h,sen s,mathur m.combined evaluation of expression of telomerase,survivin,and anti-apoptotic bcl-2 family members in relation to loss of differentiation and apoptosis in human head and neck cancers.head neck,2004,26（8）:733-740.
0 引言
我国为肝癌高发国家，据统计肝癌位居男性肿瘤患者死亡原因的第二位［1］。肝癌的发生发展与端粒酶激活密切相关。端粒酶由三部分组成，即端粒酶rna、端粒酶逆转录酶和端粒酶相关蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色体末端端粒序列时必须以自身的rna为模板［2］。端粒酶rna由450 个核苷酸组成，其中11个核苷酸为端粒合成的模板序列。我们设想，封闭端粒酶rna的模板序列，干扰端粒酶向染色体末端添加端粒序列的过程, 使癌细胞端粒长度的稳定机制破坏，就可使永生化细胞的癌细胞无限增殖受限，从根本上抑制肿瘤细胞生长。本实验目的在于观察靶向端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸对肝癌细胞端粒酶活性及肿瘤细胞生长的影响，为肝癌治疗探索一条新的、有效的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 肝癌细胞株smmc²7721，正常肝细胞株l²02，购自中科院上海细胞生物技术研究所。
1.1.2 trap反应试剂、tunel检测试剂、western单抗为宝灵曼公司产品。
1.1.3 聚丙烯酰胺银染试剂 硝酸银(agno3)，无水碳酸钠(na2co3)，购自华美生物公司。
1.1.4 仪器 beckman cs²15r低温离心机，perkin²elmer gene pcr仪，mk²2酶标仪。
1.2 方法
1.2.1 端粒酶反义dna的设计 选择近端粒酶 rna 模板区的20个核苷酸为反义靶位，设计合成端粒酶反义 dna 序列、正义序列、随机序列，见表1。硫代反义dna由中科院上海细胞所合成与纯化，纯度达98%以上。
表1 端粒酶模板区反义、正义及随机序列（略）
tab 1 the sequence of sense, anti²sense and control²scrabled
1.2.2 trap²pcr²elisa检测肿瘤细胞端粒酶活性［3］。
1.2.3 合成dna对肝癌细胞端粒酶活性的影响 1×106 smmc²7721培养于nunclon 24 孔板，培养液1ml含10% 热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5% co2 。正义、随机、反义dna终浓度为10μmol/l，以pbs为对照，作用时间分别为12、24、36、48、60h，培养结束后胰酶消化，pbs洗2次，trap²elisa法定量测定端粒酶活性，每一dna设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义dna（浓度为10、5、2.5、1.25μmol/l）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。
1.2.4 凋亡研究
(1)tunel染色观察细胞染色及细胞调亡 4×105/ml培养细胞种植于12孔细胞培养板，不同寡核苷酸作用14天后pbs洗涤2次进行细胞爬片，按tunel试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应，苏木素染色，封片，拍照。
(2)流式细胞仪细胞周期分析 1×104细胞经5μmol/l反义dna作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。
(3)dna抽提及电泳 将1×106经反义dna作用14天的细胞移入1.5ml离心管，加裂解液及蛋白酶²k，55℃水浴20min，加rna酶 10μl 作用2min，酚、氯仿²异戊醇各抽提1次，加3m乙酸钠、无水乙醇沉淀dna，3000g离心10min，气干，te溶解沉淀。 取抽提好的dna 5μl，在1.8%琼脂糖凝胶、5v/cm电压下，电泳3h，以hind² ⅲ酶切的λdna为分子标志，302nm紫外光透照并照相。
1.2.5 western分析细胞周期相关蛋白 收集经反义dna作用14天的smmc²7721肝癌细胞（以未作任何处理的smmc²7721阴性对照），裂解液裂解，蛋白产物进行sds²page电泳（15%浓缩胶，5%分离胶），电泳产物半干电转移至nc膜上（转移时间p21为45min，cyclind1、cdk2为1h），50g/l脱脂奶粉室温封闭4h，tbs漂洗3次，分别加入抗小鼠cyclind1，抗兔cdk2、p21单克隆抗体及作为内参照的β²actin单克隆抗体，4℃过夜反应，tbs漂洗3次，再加入相应二抗，室温反应4h，tbs漂洗3次后，dab显色。
1.3 统计学方法
方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 合成反义、正义、随机序列dna作用不同时间对肝癌细胞株smmc²7721端粒酶活性的影响
10μmol/l合成端粒酶反义dna对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用，这种抑制作用开始于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正义链及随机链对细胞端粒酶活性无显著影响，见表2、图1。
表2 合成dna对smmc²7721细胞端粒酶活性的影响（1×10 6/ml） （略）
tab 2 the effection of synthesised dna on telomerase activity（1×10 6/ml）
*：the difference is significant compared to the control，p<0.01
a:control scrambled;b:sense;c: anti²sense
图1 端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用（略）
fig 1 the inhibitory effect of anti²sense telomerase oligonucleotide for telomerase activity
2.2 反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用
2.2.1 tunel标记 在倒置显微镜下我们观察反义寡核苷酸作用14天的细胞，发现60%的癌细胞被染成棕色，并有凋亡小体的产生，凋亡细胞数显著高于正义序列，见图2。
a: anti²sense light microscope(×800)；b: sense light microscope(×400)
图2 端粒酶反义及正义寡核苷酸作用14天tunel染色（略）
fig 2 tunel staining for smmc²7721 after anti²sense and sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
2.2.2 dna电泳 反义寡核苷酸作用14天，光镜下癌细胞呈凋亡改变，dna抽提电泳出现凋亡条带，见图3。
a:genomic;b,c:anti²sense;d:sense
图3 端粒酶反义寡核苷酸作用14天细胞dna电泳图（略）
fig 3 the dna electrophoresis after anti²sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
2.2.3 端粒酶活性与细胞周期的关系 合成dna与1×104/ml细胞共育2周，反义dna在端粒酶活性被抑制后,s期细胞百分数下降,而g2/m期细胞百分数增高，细胞聚集于g2/m期，见表3。
表3 端粒酶dna对细胞周期的影响（n=3）（略）
tab 3 the effection of telomerase dna on the cell cycle（n=3）
*：the difference is significant compared to the control，p<0.012.3 细胞周期调控因子检测结果
反义寡核苷酸作用的肝癌细胞培养14天后收集裂解细胞总蛋白，以β²actin作内对照，western blot技术检测cyclind1(细胞周期素)、cdk2(细胞周期素依赖性蛋白激酶)和p21（细胞周期素依赖性激酶抑制因子）的表达，结果显示在β²actin等量的情况下，与正义序列比较反义寡核苷酸作用的肝癌细胞cyclind1、cdk2的表达下降而p21蛋白的表达显著增加，见图4。
图4 端粒酶反义dna作用后smmc²7721细胞周期相关蛋白的表达（略）
fig 4 the expression of cell cyclin after telomerase²antisense dna affected
3 讨论
我国为病毒性肝炎高发国家，病毒性肝炎相关肝硬化、肝癌的发生率居高不下。病毒感染可造成肝细胞变性坏死、假小叶形成。肝细胞在不断坏死及增殖过程中与病毒核酸整合而造成肝细胞端粒酶激活、无限增殖、永生化而恶变。因此，端粒酶激活在肝细胞癌变及其恶性增殖中起决定性作用［4］。端粒酶是核糖核蛋白复合体，主要功能是向分裂细胞染色体末端添加端粒重复序列以保证肿瘤细胞的无限增殖。
肿瘤细胞因端粒酶激活而恶性增殖，因此，用反义核酸来抑制或消除肿瘤细胞端粒酶活性成为近年肿瘤治疗研究的热点，核酸类药物抗肿瘤具有广泛临床应用前景［5］。研究指出：在寡脱氧核苷酸上通过共价连接引入一定的活性基团，可使该寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外，其耐核酸酶能力、与靶核酸分子结合的强度及细胞对寡核苷酸摄取等均显著增强[6]， 修饰的寡核苷酸被认为是选择性抑制基因表达的新工具和抗肿瘤治疗最有前途的新药。我们对靶向端粒酶模板区的反义dna的研究发现：反义dna能识别并与端粒酶模板rna结合而抑制肝癌细胞端粒酶活性，端粒酶活性的下降具有浓度依赖性，10μmol/l的反义dna作用12h即开始产生抑制作用，继续作用60h端粒酶活性几乎完全被抑制，实验中反义dna作用的时间延搁为12h，可能与其进入细胞的过程有关［7］。
随着肝癌细胞端粒酶活性的被抑制，肿瘤细胞出现生长阻滞，因此，端粒酶反义dna抑制肿瘤细胞增殖是通过抑制其端粒酶活性实现的。肝癌细胞端粒酶活性的抑制，意味着癌细胞失去了赖以永生化的物质基础而转为“非永生化”。
凋亡研究结果显示:端粒酶失活的癌细胞继续培养，细胞活力显著下降并出现调亡。端粒酶反义dna与肝癌细胞共育14天后，tunel染色60%的癌细胞被染成棕色，形态学上表现核深染、染色质边集、核碎裂及凋亡小体形成；细胞dna电泳呈凋亡特征性ladder，流式细胞仪研究显示s期细胞的百分数显著下降，说明发生凋亡的细胞为处于细胞周期s期的细胞[8]。
western杂交结果显示反义dna作用的肝癌细胞cdk2、cyclind1的表达量下调而p21表达增加。这就意味着端粒酶反义dna通过对端粒酶活性的抑制而影响了细胞p21的表达。有研究表明细胞周期监控机制的破坏可导致细胞基因组不稳定和基因突变，肿瘤细胞cyclind1的过度表达可缩短肿瘤细胞g1期使细胞持续生长，而p21的高表达则抑制肿瘤增殖并促进其发生分化[9]， p21能与cdk2结合形成稳定的复合物，阻止其与cyclind1的结合。我们所合成的端粒酶反义dna有可能通过细胞周期因子cyclind1、cdk2和p21的调控来抑制肝癌细胞的增殖。
端粒酶反义dna分子特异地与细胞内端粒酶rna结合，但对染色体端粒酶基因并无封闭作用，因此，反义dna对端粒酶活性的抑制是可逆的。我们将去除反义分子的细胞继续培养20天，端粒酶弱表达且不能恢复到原来的水平，发生这种现象的原因可能与下列因素有关：（1）进入细胞内的反义dna有足够量结合新转录的端粒酶rna模板序列；（2）端粒酶发挥作用必须以全酶的形式，端粒酶蛋白质成分在端粒酶活性调控中起主要作用，反义分子与端粒酶 rna 结合后可影响其蛋白质亚单位的构象或功能而影响端粒酶活性，即使细胞端粒酶rna基因有转录，其蛋白质成分也不能发挥作用；（3）端粒酶在细胞内被灭活后, 肿瘤细胞自身也发生了一系列的变化，如分化、老化及凋亡，端粒酶活性均显著降低［10］。
总之，我们的研究表明，端粒酶反义dna能抑制肝癌细胞端粒酶活性，并通过此途径抑制肝癌细胞增殖、使s期细胞凋亡。靶向端粒酶的核酸类药物有潜在临床应用前景，值得进一步研究。
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[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0090-04
周围神经损伤是显微外科常见疾病之一，常由交通意外、工矿事故等外伤引起[1]，损伤部位往往呈碾压伤、挫裂伤，造成神经较长距离缺损，单纯手术难以缝合[2]。自体神经移植一度成为治疗的金标准[3]，然而存在损伤供体部位功能的缺点，随着组织工程学的研究进展，导管支架材料联合细胞移植已经成为替代神经移植的重要方法[4]。本研究突破传统的单一细胞移植的方法，采用骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（Schwann cells，SCs）联合移植，探讨两种细胞相互作用对神经轴突再生的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032] 48只，体重（200±5）g；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司，美国）；青-链双抗（碧云天，中国）；胰蛋白酶（碧云天，中国）；Ⅳ型胶原酶（碧云天，中国）；阿糖胞苷（Ara-C，辉瑞公司，美国）；兔抗鼠单克隆抗体S-100（武汉博士德公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；兔抗鼠表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管（PLGA，山东代罡生物材料公司）；多导电生理记录仪（ASB240U，成都遨生）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨髓基质干细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，浸泡于75%酒精中10 min，无菌条件下取出双侧股骨，剪去两端，将骨髓冲到10 mL离心管中。反复吹打至单细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬。采用全贴壁培养法，将细胞接种于培养瓶中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。培养5 d后，对细胞进行换液，弃去瓶中培养液，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养。待细胞铺满瓶底80%后传代。
1.2.2 施万细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，无菌条件下取出双侧坐骨神经，在解剖显微镜下剥离神经外膜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪成0.5 mm小段，加入0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶，37℃消化30 min。吸取上清加入培养液终止消化。重复消化1次，将所得单细胞悬液移入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。1500 r/min，离心5 min，弃上清，向离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液5 mL，重悬，移入培养瓶，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。
1.2.3 施万细胞的纯化与检测 SCs的纯化采用差速贴壁离心与Ara-C抑制相结合方法[5]，每15分钟变换1次培养瓶方向，45 min后取未贴壁细胞移入新瓶。24 h后加入Ara-C培养2 d，胰酶消化后移入新瓶，待细胞铺满瓶底80%后传代。取第2代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后，加入兔抗鼠S-100单克隆抗体（1∶200），4℃过夜，加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1∶400），孵育30 min后荧光检测。在100倍显微镜下随机选取10个不同视野，计数阳性细胞与总细胞数，计算SCs细胞纯度，公式为：SCs细胞纯度=S-100阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 实验动物的分组与模型制备 48只雌性SD大鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只：A组为BMSCs与SCs联合移植组；B组为单纯BMSCs移植组；C组为单纯SCs移植组；D组仅加入PBS作为阴性对照组。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后俯卧位固定于操作台，右下肢常规备皮、消毒，取后外侧肌间隙游离暴露坐骨神经，在坐骨神经中段做一长10 mm神经缺损，PLGA导管连接两侧断端，均插入1 mm，各缝合2针。A组向导管内注入1×105/L浓度的BMSCs和SCs各50 μL；B组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；C组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；D组注入PBS 100 μL。注射完毕后逐层缝合。
1.3 指标的观察与评定
1.3.1 大体观察 观察术后切口情况，右下肢活动能力、步态变化。于4、8周处死动物后观察损伤神经的修复长度及直径。
1.3.2 坐骨神经功能指数（SFI）的测定 每组术后4、8周分别取6只大鼠，记录双下肢足印2～3对，测量损伤侧足印长度（足跟到足尖距离）（EPL）、正常侧足印长度（NPL）、损伤侧足趾宽度（第1趾到第5趾距离）（ETS）、正常侧足趾宽度（NTS）、损伤侧中间足趾距离（第2趾到第4趾距离）（EITS）、正常侧中间足趾距离（NITS）。根据公式SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3（EITS-NITS）/NITS-8.8，计算SFI值，0～-12代表正常功能，-13～-99代表功能部分恢复，-100代表无功能。
1.3.3 神经传导速度（NCV）的测定 4、8周时，每组取SFI测定完毕的大鼠，麻醉后俯卧位固定于操作台上，暴露双侧坐骨神经，游离PLGA导管两侧神经干，应用多导电生理记录仪测定双侧坐骨神经的传导速度，并进行统计学分析。
1.3.4 碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的免疫组化检测 NCV测定结束后，对各组大鼠处死，取出双侧坐骨神经，去除导管，石蜡包埋后切片脱蜡，3% H2O2浸泡20 min；加入兔抗大鼠bFGF单克隆抗体和兔抗大鼠EGF单克隆抗体（抗体稀释度1∶200），室温过夜；PBS冲洗后，加入生物素二抗（抗体稀释度1∶400），37℃孵育60 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。各例随机选取6张切片，每张切片随机选取5个高倍视野，应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值（AOD），并进行统计学分析。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓基质干细胞的分离培养
采用全贴壁培养法换液2次后，可去除悬浮的血液细胞，贴壁生长细胞以梭形为主兼有圆形、椭圆形。8 d左右原代细胞聚集呈集落样生长，连续传5代后细胞生长良好，未发生异型性改变。
2.2 施万细胞的培养与检测
坐骨神经提取的细胞经差速贴壁法换瓶后，瓶内可见折光性较好的圆形SCs细胞与胞体较大的成纤维细胞。加入Ara-C后，成纤维细胞基本消失，2 d后SCs开始贴壁生长，发出突起，胞体拉长，呈鱼群样排列。传代后细胞形态未发生改变，经S-100抗体荧光染色后，SCs的纯度为（96.2±2.5）%。
2.3 大体观察
术后各组动物全部存活，B组1只，C组2只大鼠切口出现红肿，其余未见异常。术后全部动物出现右下肢跛行，肌力较正常侧减弱。4周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经已恢复连接，修复部位直径略小于正常；B、C组坐骨神经恢复连接，但修复部位直径明显小于正常；D组仅凭借神经外膜相连。8周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经直径与正常相似且略粗；B、C组的修复效果相似，直径略小于正常；D组修复直径较4周时略增大。
2.4 各组坐骨神经功能指数绝对值比较
术后4周A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组之间差异无统计学意义（P > 0.05）；D组作为阴性对照，其坐骨神经功能仍有部分恢复。术后8周时A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、B、C组SFI绝对值均小于同组4周时，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组SFI绝对值在2个时间点差异无统计学意义（P > 0.05）。说明细胞移植在损伤4周后仍有修复，而单纯导管修复功能无恢复。见表1、图1。
2.5 神经传导速度测定
各组伤侧NCV均小于正常侧，差异有统计学意义（P < 0.05）；8周时A组损伤侧NCV优于4周时水平，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C、D组差异无统计学意义（P > 0.05），说明细胞联合移植对恢复神经传导速度的作用更为持久。4周时A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。8周A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
2.6 免疫组化检测结果
在4、8周时分别对各组标本进行免疫组化检测，测定bFGF和EGF的表达水平。4周时bFGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组，C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时bFGF测量AOD值A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。4周时EGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组、C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时EGF测量AOD值，A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。
3 讨论
周围神经损伤发生后如何提高修复神经的功能一直是显微外科面临的难点之一，常见的修复方式包括单纯缝合、自体神经移植、神经导管支架以及干细胞修复等等，单一的方法很难达到满意的效果，给患者的生活带来了极大的困扰[6]。BMSCs作为种子细胞在周围神经修复中都起到了关键作用，而SCs则能够提供丰富的营养因子，促进轴突的再生[7]。目前，体外实验表明，BMSCs与SCs共同培养表现出良好的相容性，并且能互相促进增值、分化[8]，但对二者在体内相互作用的报道较少，因此本研究利用PLGA多孔导管作为支架材料，观察BMSCs与SCs联合植入体内对损伤神经的修复效果。
BMSCs在特定的条件下具有分化为神经干细胞，进而分化为神经细胞的能力。神经干细胞能够分泌多种神经营养因子，减轻损伤所致的炎症反应，维持轴突的稳定性，防止轴索反应的扩大。损伤发生后，损伤远端SCs细胞会发生变性，产生大量的EGF和bFGF等因子，为干细胞的分化提供适宜的微环境[9]，BMSCs植入体内后，会在这种微环境下分化，使营养因子的水平呈现放大反应，加速轴突再生。同时，BMSCs分化的神经元会发出突起，交织成网，介导神经信号的传导。SCs植入体内后，会产生黏层素、Ⅳ型胶原等构成基底膜的主要成分，沿支架内壁形成神经外膜，为轴突再生提供生物支架，弥补体内原有SCs分泌的不足[10]。同时移植的SCs也能够分泌营养因子，加速BMSCs的分化作用[11]。
SFI的结果可以看出，联合移植对大鼠坐骨神经功能的恢复作用更为突出，而单细胞移植则没有差别，说明了BMSCs与SCs的移植修复作用相当，都是为轴突的再生提供了营养的支持[12]。值得注意的是，单纯导管修复大鼠仍有部分功能恢复，说明单纯应用PLGA支架材料对长距离周围神经缺损具有一定的修复作用，其可能机制为PLGA支架限制了自身SCs分泌的营养因子外流，在导管中浓聚，促进了轴突的重连。NCV测定结果与SFI基本一致，但在4周后，联合移植大鼠的NCV仍有提高，而单纯移植则不显著，说明了细胞联合移植的修复作用更为持久，这可能与BMSCs分化产生的神经元传导电活动有关，而单纯BMSCs移植由于缺乏营养因子的支持，分化的神经元比例较少。对所用损伤侧NCV可以看出，无论是那种移植方式，其NCV都不及正常侧的1/2，这也是周围损伤修复效果不理想的体现。对于无BMSCs大鼠，没有分化来源的神经元介导信号传递，仅凭借SCs产生的营养因子不能够满足损伤近端轴突的长距离生长；对于含有BMSCs大鼠，其分化产生的胶质细胞可能会阻碍神经信号的传递，两种原因都可能导致NCV的减慢。
EGF和bFGF是促进轴突生长的重要神经营养因子[13]，研究表明，二者联合作用的效果要明显强于单独应用，且二者联合应用具有诱导BMSCs向神经元分化的作用[14]。本实验检测EGF和bFGF的表达，可见短期内（4周）联合移植组营养因子的表达水平更高，BMSCs所分泌的营养因子水平高于SCs，而在长期（8周）则无明显差别，可能是与随着时间的进展，细胞分化且营养不足有关。但由于条件限制，检测尚存在不足，如果对体内的全部营养因子进行蛋白组学的鉴定，则可全面分析细胞移植对神经再生的影响。
综上所述，BMSCs与SCs联合移植能够促进损伤轴突的再生，恢复神经功能，对周围神经损伤具有明显的修复作用。
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1.1促吞噬作用
Forslid等[2]发现C3b致敏的酵母菌，中性粒细胞对其吞噬率为15％，当加入红细胞后，吞噬率增加一倍，红细胞碎片亦有相同作用。作者推测红细胞所含抗氧化剂类物质能保护中性粒细胞吞噬过程中释放的氧自由基对中性粒细胞的自身细胞毒作用，从而促进吞噬。徐瑛等[3]亦证明人红细胞能明显促进外周血多形核白细胞（PMN）吞噬功能，在红细胞存在下对酵母菌的吞噬率增加70％左右，促吞噬作用与红细胞补体1型受体（C3breceptor，CR1）数量不同有关。将肺癌患者的红细胞和淋巴细胞按一定步骤与经血清致敏的癌细胞作用，观察肺癌患者红细胞与淋巴细胞围攻癌细胞情况。结果显示：肺癌患者红细胞与淋巴细胞不仅可各自单独围攻癌细胞，且具有协同抗肿瘤免疫作用，肺癌患者红细胞对淋巴细胞免疫粘附癌细胞的促进作用较正常人降低[4]。徐瑛[3]检测了恶性肿瘤患者红细胞促PMN吞噬能力，发现患者红细胞促吞噬率明显低于正常人，认为癌瘤患者红细胞CR1减少是红细胞促PMN吞噬减弱的原因之一。郭峰等[5]发现红细胞能直接粘附肿瘤细胞，肿瘤细胞经与补体作用后粘附红细胞能力明显增强，并能促进淋巴细胞、粒细胞对肿瘤细胞的粘附，而CR1单克隆抗体能抑制红细胞粘附肿瘤细胞的活性，说明在肿瘤免疫中红细胞有免疫调控，增强其它细胞功能的作用，这种作用是红细胞膜上的CR1介导的。Siegel推测红细胞能阻止癌细胞在血循环中扩散，因为癌细胞在外周血中遇到红细胞的机会比白细胞大1000倍，癌细胞表面覆盖有抗体补体，易被红细胞粘附而被捕捉吞噬。
1.2清除循环免疫复合物
肿瘤产生的大量抗原与血中抗体形成的免疫复合物（IC）被认为是一肿瘤免疫抑制因子，是造成肿瘤免疫逃逸的原因之一。IC沉着于组织某些部位，激活补体系统，亦可造成组织损害。红细胞膜具有CR1，通过CR1，红细胞与抗原－抗体－补体复合物结合，并将其运送至肝脾固定吞噬系统，IC从红细胞上解离，被吞噬细胞吞噬清除，释放IC后的红细胞可再回到血循环中，仍具有结合IC的能力[8]。CR1为分子量205000的糖蛋白，存在于红细胞、B细胞、PMN及单核细胞上，每种细胞所含CR1数量不同，红细胞为950，B细胞为2100，PMN为57000，单核细胞为48000，从数字上看每个红细胞所含CR1数仅为有核细胞的1/20～1/50，但由于血循环中红细胞数为有核细胞数的1000倍，而血循环中95％的CR1是分布于红细胞上的，清除IC主要是红细胞而非白细胞。Medof[6]等的体外试验结果支持上述推测，他们将抗原－抗体－补体的复合物与人血细胞混合孵育，然后测定各类细胞结合复合物的数量，结果发现红细胞结合了82.8％～84.8％的复合物，而中性粒细胞与单核细胞分别结合了8.3％～15.2％和1.6％～5.8％的复合物。最近发现红细胞CR1与有核细胞CR1在功能和结构上不同，红细胞CR1在细ど系姆植汲蚀匦?cluster)。Paccaud等[7]比较了PMN与红细胞结合IC的能力，发现在相同细胞浓度下，PMN结合IC能力与红细胞结合IC能力相同，尽管PMNCR1数量是红细胞CR1数量的4倍，在相同CR1数量条件下，静止的或激活的PMN结合IC的能力始终低于红细胞。电镜下发现红细胞上50％的CR1呈簇性分布，而PMN小于15％，激活的PMN虽CR1数量增加，但簇性CR1的数量并不增加，因而认为PMN的功能是组织吞噬，清除IC为红细胞的功能。
1.3效应细胞样作用
红细胞表面有过氧化物酶，能使红细胞直接销毁粘附的抗原物质，从而起效应细胞样作用。郭峰等[6]发现红细胞能与多种癌细胞发生粘附包括血清致敏的肝癌原代、传代细胞株，鼠淋巴母细胞瘤，艾氏腹水癌细胞，各种肿瘤细胞与红细胞形成花环的百分率平均值大16％～60.97％。电镜下可见红细胞发生变形运动以顺应肿瘤细胞的表面形态，甚至还可发生阿米巴样运动，包绕坏死的肿瘤细胞碎片，粘附处的红细胞膜与肿瘤细胞膜粘附、融合。肿瘤细胞与红细胞结合处有破损现象，在红细胞中可见癌细胞碎片，这种粘附作用可被CR1单抗或C3多抗阻断。
1.4红细胞对淋巴细胞和细胞因子的调控作用
Yaelli[8]等观察了红细胞对LAK细胞杀伤活性的影响，作者采用51Cr释放微量细胞毒法检测了12例癌症患者LAK细胞对Daudi肿瘤细胞的杀伤活性，发现在培养时未用Ficoll－Hypaque液离心除去红细胞者其LAK细胞活性较除去红细胞者增强1～3倍，最大1例达20倍，进一步发现红白细胞比从3～100:1时，溶解瘤细胞活性逐渐增强，在100:1时至少增加2倍，并证明红细胞的增强作用是在LAK细胞培养的诱导期且需要细胞间的接触。因而认为制备LAK细胞时不需要分离除去红细胞，相反加入适量的红细胞对增强LAK细胞毒活性更为有益。
NK细胞(Naturekillercell)在体内担负着重要的免疫监视功能。红细胞能直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，Shou等[9]检测了在红细胞存在下NK细胞毒活性，发现红细胞与效应细胞比值为1.3:1时NK细胞毒活性开始增强，在2.5～20:1时增加最明显，不论自体，同种异体或异种红细胞都能使NK细胞活性增强，但破碎的红细胞无增强作用，增强作用可能与NK细胞上补体受体有关。郭峰[6]亦发现，当在效：靶：RBC比为10:1:25的条件下时加RBC组NK细胞活性明显高于未加RBC组。肿瘤患者红细胞对NK细胞活性的正性效应降低。Shou[10]最近发现在RBC的胞浆内存在着一种自然杀伤细胞增强因子(NatureKillerEnhancingFactor,NKEF)能增强NK细胞活性，并对其理化特性做了初步分析，认为RBC在调节NK细胞方面可能起着重要的作用。
Sigfuon等[11]发现，用美州商陆丝原刺激淋巴细胞转化，加自身红细胞可增加淋巴细胞转化率和IgG、IgM、IgA的合成。Virella等[12]进一步实验发现，在培养前红细胞与抗LFA－3单克隆抗体作用或淋巴细胞与抗CD2的单克隆抗体作用后培养时不增加B细胞反应，说明淋巴细胞转化合成抗体与红细胞LFA－3和淋巴细胞CD2相互作用有关。
红细胞能使人T细胞增殖加强，促进T细胞IL－2受体表达以及肿瘤坏死因子[13]和γ－干扰素产生[14]。用PHA刺激人外周血单个核细胞可诱导干扰素产生，Keyes等[14]发现在培养时加入红细胞可使干扰素产量增加4～10倍，干扰素产量随红细胞与淋巴细胞比值关系而变化，最适宜浓度为10～50:1。红细胞的促进作用与血型无关，红细胞碎片亦有相同刺激作用，抗CD2的单克隆抗体可抑制红细胞对T细胞产生干扰素的促进作用。Kalechman等[15]亦发现在培养时加入自身RBC可使人单核细胞或鼠脾细胞对亚适合剂量的丝裂原的反应增强，包括细胞增殖，IL－2、IL－3、IL－6、克隆刺激因子及γ－干扰素的分泌增加，这种增强效应为剂量依赖性的。还发现在无丝裂原存在下RBC能增强人单核细胞及鼠脾细胞IL－2R的表达，这种增强效应与红细胞膜与T细胞上的CD2分子相互作用有关。
2红细胞免疫功能的调控及意义
Siegel等[1]在兔血清中发现了抑制红细胞免疫粘附的因子，该因子为一不耐热物质，58℃30分钟可除去其活性，推测该因子为一大分子物质，机体通过控制该因子的合成来调节红细胞免疫功能。Yin等[16]发现该因子为一种球蛋白，对热不稳定，有与赖氨酸结合的位点，该因子可阻止IC粘附到红细胞上，降低红细胞粘附携带IC的能力。郭峰等[17,18]还发现血清中除存在红细胞免疫抑制因子外，还存在着红细胞免疫粘附促进因子，该因子耐热，58℃不能灭活。在正常人血清中促进因子活性明显大于抑制因子，肿瘤患者抑制因子活性上升，促进因子活性下降，因而认为机体内存在着红细胞免疫正负调节机制，该调节机制紊乱可能是某些疾病发生发展的原因。最近还发现β内啡肽、胸腺素、转移因子[6]等对红细胞免疫功能有促进作用，说明神经内分泌系统、白细胞系统亦参加红细胞免疫功能的调控。临床上已发现肿瘤患者血清中红细胞免疫抑制因子活性增强。
3肿瘤红细胞免疫功能改变
章岳山等[19]发现，近交系615小鼠在接种可移植性组织细胞淋巴瘤LII后，小鼠红细胞免疫功能随着肿瘤的发展呈下降趋势，在肿瘤侵袭早期和中期下降最为迅速，而肿瘤转移开始至肿瘤转移晚期以后，其下降速度减慢，认为这一改变可作为评估肿瘤发展程度的参考指标之一。
Currie等[20]采用抗CR1单克隆抗体检测肿瘤患者红细胞CR1受体数，发现在Hodgki病、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌和淋巴瘤，其CR1受体数较正常人减少将近一半，而在缓解期均有不同程度的恢复，因而认为红细胞CR1减少为获得性的，对红细胞CR1检测可能对判定肿瘤患者病情转归有意义。已发现在乳腺、胃、大肠、肝、卵巢、血液系统等多种肿瘤患者CR1活性降低。红细胞CR1减少，一方面使红细胞对肿瘤细胞的调理促吞噬作用功能降低，另一方面导致IC清除障碍，循环中IC增高。在肿瘤患者血清中存在着促进肿瘤生长的因子，称封闭因子，目前认为该因子为肿瘤抗原与抗体形成的免疫复合物，IC增高加重破坏了宿主抗肿瘤免疫能力，造成恶性循环，肿瘤细胞逃逸宿主免疫系统的攻击得以生长繁殖。
Siegel[1]推测红细胞能阻止癌细胞在血循环中的扩散，但缺乏证据。郭峰等[6]证明红细胞与癌细胞能发生粘附，在艾氏腹水癌腹水中发现了红细胞包绕癌细胞形成花环的现象即为一例证，从而在形态学上有力地支持了Siegel[1]的这一推测，更重要的是红细胞与癌细胞发生粘附后除可促进吞噬细胞吞噬外，红细胞本身还表现出效应细胞样作用，这一新发现对探讨红细胞在肿瘤免疫中的作用很有意义。已发现荷瘤小鼠红细胞粘附肿瘤细胞能力明显低于正常鼠；临床上，已发现在乳腺癌、胃癌、食管癌等患者，红细胞粘附肿瘤细胞能力降低，同时还发现在消化道癌患者肿瘤红细胞花环率高低于手术后证实肿瘤发生转移与否有相关性，手术切除肿瘤可使患者的红细胞免疫功能改善。因而，检测红细胞免疫功能可能对判断肿瘤转移，疗效估计及预后有一定价值。Nieha等[21]最近在多种癌细胞上检测到补体抑制蛋白CD46(MCP)，CD55(DAF)及CD59(Protectin)的表达，CD46可协助I因子加速对C3b的灭活，避免C3b沉积在癌细胞表面，从而使红细胞不能通过其CR1受体与癌细胞发生免疫粘附，这可能是肿瘤免疫逃逸的机制之一。
红细胞免疫功能提出至今已取得了很大进展，但许多问题尚待澄清。肿瘤患者红细胞CR1减少是肿瘤发展过程产生的还是引起肿瘤的原因之一？抑制因子及促进因子的来源性质，相互作用机制及在肿瘤发病中的作用，红细胞粘附肿瘤细胞的意义等仍需做进一步的研究。另外能否通过药物调节红细胞免疫功能来治疗某些疾病亦是今后需进一步研究的方向。
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1 中医脏腑理论中肾的功能
现代中医理论认为，肾的主要生理功能包括：主藏精，主水，主纳气[1]。肾主水，是指肾具有主持和调节水液代谢的作用，这种功能同西医的泌尿系统没有差异。中医界也把泌尿系统纳入脏腑中的肾，男性生殖系统归为脏腑中的肾后能够部分解决肾藏精的问题，但仍让人感到欠缺。了解肾精的生物学含义是解决中医五行相生的着眼点。
肾藏精是指肾具有封藏和存储人体精气的作用。《素问・六节藏象论》说：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。”精的含义有广义和狭义之分。狭义之精是指禀受于父母而储藏于肾的具有生殖繁衍作用的精微物质，又称生殖之精。这相当于解剖中的生殖系统，特别是男性生殖系统。广义之精泛指构成人体及维持人体生长发育、生殖和脏腑活动的精微物质，是生命之源，故《素问・金匮真言论》说：“夫精者，身之本也。”精的来源有两种，即先天之精和后天之精。先天之精又称肾本脏之精，是禀受于父母，与生俱来的构成人体原始生命物质；后天之精又称五腑六脏之精，是由脾胃化生并灌溉五腑六脏的水谷精微[1]。
这里五谷之精和西医所指的营养物质几乎没有差别。而先天之精，即肾精的含义远超出了现代西医泌尿生殖系统的功能。中医没有结合现代生物学、生理学等学科来定义肾精的含义，但是也大致描述出肾精的功能特点，这些特点包括：①促进生长发育作用；②主生殖；③化生血液；④抵御外邪[1]。如果能够在现代西医研究成果中找到符合上述特征的解剖结构和细胞系统也就可以被认为是肾精。近些年关于干细胞的研究恰好有利于中医关于肾精的的理解。
2 干细胞研究进展以及与肾精的关系
早在19世纪末，已经有科学家在医学文献中使用“干细胞”这个词。干细胞的研究是在20世纪90年代才不断取得突破、发展，美国《科学》杂志公布的1999年十大科学成果中名列榜首，并于2000年再度入选世界十大科学成果。简单的讲，干细胞是指一类具有无限的或者较长期的自我更新能力而尚未分化的细胞，它能够产生至少一种以上类型的特化细胞。根据这一定义，在个体发育的不同阶段的不同组织均存在着干细胞，只是随着发育过程的延伸，干细胞的数量和分化潜能均逐渐下降[2]。
根据研究的目的不同，干细胞的分类主要有两种方法：一种方法是按其分化潜能的高低将干细胞分为全能干细胞，三胚层干细胞，单胚层干细胞和单能干细胞。另一种方法是根据细胞来源将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，前者是指源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞和来源于早期胎儿原始生殖嵴的生殖干细胞；成体干细胞是指组织和器官特异性干细胞。现在研究表明，并不是在人体所有组织和细胞中分离鉴定出成体干细胞，而且成体干细胞在数量上是非常少的，很难分离和纯化，且随年龄增长其数目会减少。在现今干细胞的治疗领域，多采用骨髓干细胞作为干细胞的来源，如治疗心肌梗塞、缺血性脑血管意外、脊髓损伤，血管闭塞、慢性肝病等疾病时多采用骨髓干细胞[3-6]。骨髓中造血干细胞仅占骨髓有核细胞的0．5％，以往认为造血干细胞只能分化为红细胞，白细胞等血细胞，而不能生成其它类型的细胞。但在1997年，Egltis等发现将骨髓干细胞移植到骨髓已经被破坏的小鼠体内，结果被植入的骨髓干细胞分化为神经干细胞，这表明骨髓干细胞在一定条件下可以像胚胎一样重新分化，生成其它组织类型的细胞[7]。因此，有人也提出这样的观点：在某种意义上，造血干细胞是全能干细胞存在于成熟个体的一种形式。成熟个体干细胞参与组织损伤的修复可能存在两种形式：一是相应组织内固有的干细胞参与修复，二是组织损伤动员骨髓释放造血干细胞，后者通过血液循环到达组织，在特定的环境下进行增殖分化，最终转化成为该组织细胞，以完成结构和功能的重建，而后者有可能起主导作用[2]。
2．1 促进生长发育作用：受精卵是最全能的干细胞，受精卵形成后就会沿着生命特有的规律进行分裂、增值和分化，多数情况下是会发育成为一个成熟的个体。换而言之，发育成为一个成熟的个体是受精卵功能的体现。受精卵形成过程就是与卵子结合的过程。来源父方，卵子来源于母方，受精卵是禀于父母而形成，这也与肾精的来源相符。
2．2 主生殖：这里需要指出的是，在我们对解剖系统进行五行划分时，女性生殖系统是归于肝木。中医认为，女性之本在于肝，而女性和男性最大的区别在于生殖系统的差别。女性生殖系统中的卵细胞在女性出生是就已经形成，并一直储存在卵巢中，不可能通过干细胞分裂增生而增加，而我们在对五行相克关系进行探讨时也已经指出肝木有物质存储的功能（文章待发表）。女性生殖系统划归肝木即遵循了女性生殖系统的特点，也遵从了中医理论。男性生殖系统与此相反。男性的来源于生精干细胞进行的减数分裂，这种分裂不是出生前后就形成，而是在性成熟后才开始。男性的形成是生精干细胞的功能，因而男性生殖系统划归肾精。
2．3 化生血液：现代西医对骨髓干细胞的最初认识就是血液生成的作用。近来的研究表明，不仅骨髓干细胞可以化生血液，生成多种体细胞，其他的成体干细胞也可以化生血液的功能，如神经干细胞等[7]。
2．4 抵御外邪：干细胞抵御外邪的是通过两种途径。其一，骨髓干细胞通过生成粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞抵御外源病原体的入侵。其二，在局部组织更新和修复中，组织或者器官特异性干细胞通过自身分裂、增生和分化完成局部组织的修复，如肠粘膜上皮和皮肤上皮细胞的更新。第三，骨髓干细胞可以迁移到受伤组织，转化成为组织特异性干细胞后再分裂为体细胞，从而完成组织修复。
由上述论述可见，干细胞系统基本符合肾精所有功能特征。在此，需要补充说明肾主骨的问题。既往对肾主骨只是从肾脏对钙磷的代谢角度来论述，考虑到骨髓干细胞存在于骨髓腔这一解剖现象，肾主骨就不仅是调节骨质代谢的问题，还有储存和释放干细胞的功能。
2．5 肾精与五行相生的关系：明确肾精的现代生物学含义后，先天五行的起点问题基本得到解决。那么，干细胞同五行相生到底是何种关系，要解决这个问题就先得明确中医整体性的思维方式。
中医思维的整体性是中医学的一大特点。这种整体性体现在对某一生命现象的整体把握上，这种整体把握就需要看到生理现象的出现、增强、顶峰、衰落和消失等过程。我们在讨论五行相克的时候已经明确看到，五行相克所形成的环恰好是能量代谢的整个过程，这个过程可以划分成为五个阶段，并有相应的脏器参与（文章待发表）。在对相生关系进行讨论时就需要从干细胞动员分化一直到体细胞形成这一整体过程来讨论相生。
干细胞最终要发育成为体细胞后才能更有效的完成特定的生理功能，这是一种必然过程。以红细胞生成为例，红细胞是由骨髓干细胞分裂增生而形成。髓系干细胞经过动员，分裂分化成为早期红系祖细胞（BFU-E），晚期红系祖细胞（CFU-E），原始红细胞而最终形成成熟红细胞。只有成熟的红细胞才能参与氧气的输送和转运。在这一过程中，包括各种细胞因子在内的多种调控因素和营养物质的支持是红细胞生成的必要条件。
由红细胞的生成我们可以得到一个一般规律：即体内任何体细胞的形成均要经历由干细胞到体细胞形成的过程。当个体成熟以后，骨髓干细胞成为一种细胞储备，经动员后在一定的环境、多种因素的调控和营养支持的条件下增值分裂并分化成为体细胞。干细胞为肾精，属肾；干细胞的存储和动员属于肝木，肾精由肝木来存储是肝肾同源的理论基础；干细胞增殖分化的调控属于心火的作用；与干细胞分裂分化过程中的营养物质支持为脾土的功能（脾统血）；最终分裂分化完成后归于肺金（肺成形）。这种排列过程基本符合相生的过程。因此母代干细胞形成子代细胞的过程基本就是相生的过程（具体见表1）。
当然，从干细胞分裂形成子体细胞需要通过多次分裂而完成。母代干细胞经历一次相生过程，形成子代细胞，相对于母代干细胞而言，子代干细胞出现一定程度的体细胞化。如果子代细胞仍具有一定分裂分化能力，仍可以被认为是干细胞，并可以进入下一次的相生过程。如果子代细胞为最终的体细胞则将参与能量代谢过程，完成代谢功能后离开相生体系，走向死亡。
3 能量代谢的相克过程和干细胞相生过程的关系
通过对相生相克的探究可以发现，机体内部的相生相克过程是最基本的两个生理过程，相生过程为干细胞的增殖和分化，相克过程为能量代谢过程。这两个过程是相辅相成的，相克过程为相生过程提供能量和物质基础，相生过程为相克过程提供生理结构基础。相克过程为能量代谢，是功能的体现；相生过程为干细胞的增殖分化过程，为生物学基础，并以储备的形式而存在。
虽然如此，我们也只论述了相生和相克环的生物学含义。中医基础理论博大精深，阴阳五行只是核心内容之一，仍有大量的细节需要详细论述。如脏腑五行中各有阴阳，脏腑中的阳为功能体现，为特定的能量代谢过程；阴为储备，体现在干细胞特定的分化过程。在不同的脏腑中，这二者的关系如何？以何种角度、何种方式来结合现代医学、生物学成果来阐述？这些都值得进一步研究。
总之，一阴一阳即为道，能量代谢过程和干细胞相生的过程是部分多细胞生命中最重要的两个环。就人而言，生命的生物学本质就是以干细胞增殖分化为基础的能量代谢过程。
4 参考文献
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(1)一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位。
一切有机体均由细胞构成，只有病毒是非细胞形态的生命体。
(2)细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位。在有机体一切代谢活动与执行功能的过程中，细胞呈现为一个独立的、有序的、自动控制性很强的代谢体系。
(3)细胞是有机体生长与发育的基础。一切有机体的生长与发育是以细胞的繁殖与分化为基础的，这是研究生物发育的基点。
师：简单地说，细胞增殖的结果是细胞数目的增多。请同学们思考一下，结合你已有的知识经验，能否用自己的语言说出细胞增殖有何意义？如果你觉得语言组织有些困难，可以参考一下教材P112有关细胞增殖意义的描述。
（学生或自我描述细胞增殖的意义，或看书轻读细胞增殖的意义。）
师：也许同学们对“细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础”这样的描述不是十分理解，通过我们接下来的学习，也许你会慢慢体会到细胞增殖于你我、于每一种生命存在的价值。
师：我们知道，由细胞构成的生物包括原核生物和真核生物，接下来我们将学习真核生物细胞增殖的方式。真核细胞的分裂方式有三种：有丝分裂、无丝分裂、减数分裂。这个单元我们主要学习有丝分裂。
播放有丝分裂动画。
师：有丝分裂是真核细胞进行细胞分裂的主要方式。连续分裂的细胞一般都会出现上述周而复始的变化，即细胞体积先长大然后细胞一分为二。我们把细胞这种连续的变化称之为细胞周期。
师：从上述动画看，你觉得一个细胞周期应该可以划分为哪些大的阶段？细胞周期有起点与终点吗？
生：从动画上看，我觉得细胞周期划分为细胞长大与细胞分裂两个大的阶段。对于细胞周期的起点与终点我不能肯定。
师：请同学们阅读教材中细胞周期的定义，找出定义中的关键词。
生：上一次分裂结束开始到这一次分裂结束为止，是一个细胞周期，包括分裂间期和分裂期。
生：我觉得细胞周期有一个前提――连续分裂的细胞才有细胞周期。
教师呈现下图。
师：上面这幅图中，表示一个细胞周期的应该是哪些罗马数字的组合？这些数字分别代表了细胞周期的哪一阶段？
生：我觉得一个细胞周期可以是Ⅱ+Ⅲ，也可以是Ⅲ+Ⅳ，其中的Ⅰ、Ⅲ代表了分裂间期，Ⅱ、Ⅳ代表了细胞分裂期。
生：我觉得他的答案有问题，细胞周期的起点是从上一次细胞分裂结束开始的，那么就意味着在一个细胞周期中，分裂间期在前，分裂期在后。所以我觉得Ⅱ+Ⅲ不是一个细胞周期。
师：请同学们再回到细胞周期的概念，对上述两位同学的回答作出评判。
生：我觉得的确Ⅱ+Ⅲ不是一个细胞周期。
师：的确，一个细胞周期开始于上一次细胞分裂结束，终止于这一次细胞分裂结束。细胞周期是有起止点的，这一点与数学中的周期存在着不同，尽管也是周期。
师：请同学们阅读教材P112的表6-1，从表格的数据中你可以获得哪些信息？
生：不同细胞的细胞周期时间长短不同，总体来说，分裂间期的时间比分裂期的时间长。
师：很好。我们接下来进一步学习在细胞周期中到底发生了哪些主要变化。
教师动画演示：细胞有丝分裂的过程。
师：从刚才的动画我们可以对细胞有丝分裂有一个大体了解，有丝分裂的结果是细胞的一分为二，得到两个相同的细胞；近观过程可以发现有丝分裂包括了核分裂和质分裂；近观结果可以发现，有丝分裂所形成的子代细胞与亲代细胞中所含有的染色体数目相同，保证了前后代之间遗传性状的稳定性。
师：请同学们猜想一下，细胞有丝分裂过程中，如何能够保证亲代细胞染色体平均分配到子代细胞中且保持数目的不变？
生：在细胞有丝分裂过程中会发生染色体的加倍以及平均分配，这样子代细胞才能够与亲代细胞拥有相同数目的染色体。
教师呈现下列图片：
师：正常细胞中的染色体是丝状的，许多染色体缠在一起，那么有哪些机制保证这些染色体在加倍、分离的过程中不受“伤”呢？那么染色体是如何实现加倍的？有何机制保证染色体的平均分配？
师：请同学们阅读教材P112-P113，特别注意主要细胞有丝分裂各期中发生了哪些变化，提取出每一时期的关键事件，并且尝试回答上述问题。
学生阅读教材，然后结合教师所呈现的动画说说细胞有丝分裂过程各期的主要特点，并且列出问题清单。
学生之间相互提问，相互回答。
（学生所列问题清单，主要是对同伴的考查，主要问题有“细胞分裂时期的主要特点是什么？染色体在哪个时期复制？染色体在哪个时期加倍？”等，相互交流的焦点集中在有丝分裂各时期发生了什么上。但几乎没有学生涉及比如“细胞有丝分裂过程中，如何能够保证亲代细胞染色体平均分配到子代细胞中且保持数目的不变？”等问题的分析和回答。）
教师展示下列PPT，帮助学生对细胞有丝分裂过程有一个总体的认识。
师：现在我将植物细胞有丝分裂各期的关键事件呈现出来，你与之进行比较，看看你或我是否有遗漏或不足。
生：我觉得中期还有一个需要补充，中期是辨认染色体形态、数目的最好时期，因为这个时期染色体高度螺旋化。
师：不错。刚才同学们与我一起对植物细胞有丝分裂的过程有了一个初步的认识。现在回到我们开始的问题，细胞分裂中的染色体是如何实现加倍的？有何机制保证染色体的平均分配？
生：通过DNA的复制和有关蛋白质的合成，实现了染色体的复制。
师：在分裂过程中，你觉得哪些变化与染色体的平均分配有关，或保证了染色体的平均分配？
生：着丝点的分裂，是染色体分开；纺锤丝的牵引使染色体平均移向两极。
生：我觉得还有一些机制，但我和周围的同学交流后我们感觉都似乎说不清。
教师展示下图：
师：请同学们用自己的语言描述其中的变化。
生：我知道了，染色体螺旋化由丝状的染色质变为棒状的染色体，可以避免染色体在分离时受到损失，而丝状的染色质容易打结断了。
教师呈现下图：
师：螺旋化后的染色体为什么不直接进入后期（即图示中的④过程），而先是着丝点排列在赤道板上再进行染色体的平均分配（即图示中的②和③过程）？你觉得细胞分裂过程中核仁解体、核膜消失有何意义？
生：我刚才在看书的时候也有这个疑问，染色体螺旋化后为什么要先排队再分家？
师：有同学能够给出答案吗？
（学生普遍摇头。）
师：通常细胞中的染色体是散乱在细胞核中的，如果我们班的同学乱七八糟地散在班级中，我们要把同学们进行平均分配，要求单号同学在班级的前面、双号在班级的后面，我们以图示④的方式或者②和③的方式都可以达到目的，你觉得哪一种能够保证在分配过程中的安全性？
生：我可以理解螺旋化后的染色体为什么不直接进入后期，而先是着丝点排列在赤道板上再进行染色体的平均分配了。
生：我现在对核仁核膜的变化也有答案了。在分裂过程中，一切活动都是围绕着染色体的平均分配进行的，这时核仁和核膜对染色体的平均分配有一定的阻碍，所以它们会消失和解体，当染色体平均分配结束后，核仁、核膜再次形成。
教师播放植物有丝分裂过程视频。
师：同学再回头考量一下有丝分裂，你们肯定也发现了，我们始终是围绕染色体的变化在讨论。你能够用文字、箭头的形式给出有丝分裂过程的知识结构示意图吗？
学生自我绘制，然后进行相互讨论。最后请一个学生在黑板上绘出知识结构图。
师：你觉得上述结构图告诉我们有丝分裂最重要的特征是什么？
生：染色体的复制与平均分配。
师：子代与亲代细胞拥有相同的染色体，这有何意义？
（学生表现得比较困惑。）
师：友情提醒一下，染色体的主要成分是什么？这种物质有什么功能？如果你还是感到困难，可以回到教材P113以及P29，也许你会有答案了。
师：刚才我们完整地学习了植物细胞的有丝分裂过程，我们现在可以回答在分裂过程中，如何能够确保亲代细胞染色体平均分配到子代细胞中且保持数目的不变，知道了有丝分裂的最主要特征是什么，同时我们还知道了有丝分裂具有怎样的意义。
师：动物细胞也能进行有丝分裂，那么下一节课我们要讨论的一个话题是，动物细胞的有丝分裂与植物细胞的有丝分裂有何异同？同时我们还要解决一个问题，为什么生物体的生长不能通过细胞的无限长大来实现？
下课。
【教学反思】
如果请学生列举高中生物中比较难学的知识，“细胞的有丝分裂”几乎成了学生共选的内容。但恰恰相反的是，没有几个教师会认同这个选择。教师觉得这个内容就是记住有丝分裂中染色体的变化，没有什么难点可言，而学生认为，教师一讲就明白，听后就忘记，反复记忆反复遗忘。一对矛盾，困惑了我许多年，我试图寻求导致矛盾形成的焦点，以便能够很好地解决矛盾。在教学中，我运用课件动画增加知识的直观性，通过实验增强知识的辨别性，等等，但似乎成效并不明显。2011年11月，接到了省教研室的通知，要我在江苏省首届生物学科特级教师论坛上开设一节观摩课，课题就是“细胞的增殖（一）――细胞的有丝分裂”，借校借班上课。据了解这所学校生源质量一般，学生基础相对比较薄弱。我上课的班级有50人之多，学生的总体思维品质及学习能力都较弱，总体情况是我所不熟悉的。接到任务，感到有些担忧，担忧的不是学生而是我，我不知道该怎样把抽象的有丝分裂转化为生动的生命过程。情急之下，向朱正威先生请教，朱先生给了我一句话：别怕，抓住核心概念进行教学。这句话让我茅塞顿开。
所谓核心概念，应该是位于学科中心的概念性知识，包括了重要概念、原理、理论等的基本理解和解释，这些内容能够展现当代学科图景，是学科结构的主干部分。认真分析《细胞的生命历程》一章，其核心概念应该包括以下内容：细胞能够生长、增殖、分化、衰老、癌变和死亡，以及细胞具有全能性。细胞增殖这一核心概念是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础，其中又包含如细胞增殖、细胞周期、有丝分裂等核心概念。有丝分裂的本质应该成为其中的核心知识。回顾我们传统的有丝分裂教学，往往强调的是对有丝分裂过程中染色体形态、数目等事实信息的记忆和背诵，一味地讲分裂过程中各个时期各自的特点，甚至将各自特点还编成口诀，让学生去死记硬背，对于有丝分裂的特征及本质往往是一带而过。这样做只能触及表面性的事实知识，学生没有对有丝分裂的本质加以理解，最终的结果只会使有丝分裂的相关知识支离破碎，缺乏有机联系，于是遗忘就成为常态。我认为，在有丝分裂过程中，染色体的复制、着丝点的分裂、染色体形态变化乃至分裂前后染色体数目不变等诸多的问题，应该是围绕有丝分裂最本质的“分裂前后遗传物质保持相对稳定”这一核心原理展开的，学生最终能够理解细胞周期中染色体的行为和数目变化对子细胞的意义，能理解有丝分裂的本质。这样，我们的教学重心应该从讲授有丝分裂过程如核仁的消失、染色体的形态变化等，转移到借助于这些事实，让学生理解有丝分裂的本质，即分裂前后遗传物质保持相对的稳定性方面来。
基于上述认识，我在“细胞增殖（一）”的教学主线是：引导学生通过对有丝分裂过程的认识，理解有丝分裂的本质。其中抓住染色体的变化以及变化背后可能的原因进行教学，采取了多种教学与学习策略，比如动画的演示、学生的自我学习与相互交流、师生的共同总结，等等，均围绕有丝分裂的本质而展开，以此吸引学生充分展开思维活动。学生知道了细胞有丝分裂过程是如何进行的，懂得了有丝分裂的生物学意义，学习活动就不会仅仅停留在记住有丝分裂过程中染色体、DNA等变化的生物学概念知识，而是通过对相关过程的学习，认识到了有丝分裂的本质特征。
【关键词】 蛋白激酶c我反义核酸们肝肿瘤 化学治疗 聚乙烯亚胺
原发性肝癌是一种对化疗药物不敏感的恶性肿瘤[1] 。有报道在肝细胞癌变过程中,细胞信号转导异常起到了关键的作用,其中pkcα表达异常与肝癌的发生发展密切相关[2, 3]。反义寡脱氧核苷酸可以通过转录后抑制来抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡，但是细胞摄取率低、易被核酸酶水解，且使用剂量过大，费用昂贵。阳离子聚合体pei作为asodn载体可以显著提高其转染效率[4]。临床常规抗肿瘤药物虽然抗肿瘤效果肯定，但是其毒副作用大，易产生耐药性，病人耐受差，同样难以起到令人满意的效果[57]。因此，本实验研究旨在探讨用聚乙烯亚胺作为载体，pkcα asodn联合5fu、hcpt、as2o3等常规抗肿瘤药物作用于肝癌细胞，增强常规化疗药物的抗肿瘤作用，降低用药剂量，从而提高病人的生存时间和生活质量，减轻病人的经济负担。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人肝癌smmc7721细胞由中山大学生物化学教研室惠赠；用含10%新生牛血清，rpmi1640培养。
1.2 试剂 cck8（cell count kit8）试剂（日本同
仁化学研究所）；新生牛血清（天津tbd广州展晨）；pkcα asodn（北京塞百盛基因技术有限公司）,全硫代修饰,page纯化, -20℃冻存,使用前用无酚红rpmi 1640培养液溶解。pkca antisense：5′gttctcgctggtgagtttca3′。
1.3 wst8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期、苔盼兰拒染率> 95%的细胞, 调整浓度为5 ×104/ml, 每孔100μl, 接种于96孔板,设3 复孔, 培养4h, 待贴壁达40%～50%后,加入药物。设空白对照组、单纯asodn组、单纯化疗药物组、asodn 联合化疗药物组和peiasodn联合化疗药物组,各组pkcα asodn浓度均为0.25μg/ml; pei与pkc质量比为3∶4，见表1～3；培养48h后, 每孔加入cck8试剂10μl, 继续培养1h, 多功能酶标仪(biorad)测定吸光度a450nm (激发波长450nm, 参比波长655nm), 计算增殖抑制率及各组ic50；增殖抑制率＝[a（对照组）－a（实验组）]/a（对照组）×100%；各化疗药增敏倍数＝单纯用药组的ic50/ 联合用药组的ic50。
1.4 统计学方法 所有数据均用±s表示，使用统计软件spss 13.0。
1.5 金正均q值法[8]判断化疗药物与反义核酸联合使用的效果 q = ea + b/(ea + eb ea ×eb), ea和eb 分别为单用反义核酸和单用化疗药物的抑制率,ea + b为合并用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”,分母是“期望合并效应”,q 值是两者之比,q< 0.85为拮抗,0.85≤q< 1.15为相加,q ≥1.15为协同。2 结果
2.1 5fu与peiasodn联合使用效果 单用5fu的ic50为15.64μg/ml;5fu与asodn联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85), ic50为26.74μg/ml;5fu与peiasodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为3.9μg/ml, 增敏倍数为4.01,见表1、 4。
2.2 as2o3与peiasodn 联合使用效果 单用as2o3的ic50为4.93μmol/l; as2o3与asodn 联合使用,表现为拮抗作用(q<0.85), ic50为5.33μmol/l; as2o3与peiasodn联合使用,表现为相加作用(0.85≤q<1.15), ic50为2.67μmol/l, 增敏倍数为1.84，见表2、 4。
2.3 hcpt与peiasodn 联合使用效果 单用hcpt的ic50为4.18μg/ml; hcpt与asodn 联合使用,表现为相加作用(0.85≤q <1.15), ic50为3.1μg/ml，增敏倍数为1.34; hcpt与peiasodn联合使用,表现为协同作用(q≥1.15), ic50为1.46μg/ml, 增敏倍数为2.86,见表3、 4。
3 讨论
蛋白激酶c已经成为肿瘤研究领域的热点之一。研究发现,pkcα 磷酸化后活化多种蛋白分子，引起分化、增殖、胞膜转运、基因表达等一系列细胞反应。 药物或反义技术封闭pkcα 表达和活性, 可以抑制肿瘤细胞的生长、 促进凋亡、 抑制侵袭转移,以及增强对化疗药物的敏感性[9]。研究表明pkcα反义核酸可以抑制胰腺癌、宫颈癌等肿瘤的表1 不同浓度的5fu及其联合asodn 或peiasodn对smmc7721细胞增殖抑制作用的比较表2 不同浓度的as2o3 及其联合asodn或peiasodn对smmc7721细胞增殖抑制作用的比较(μmol/l)表3 不同浓度的 hcpt及其联合asodn或peiasodn 对smmc7721 细胞增殖抑制作用的比较 as为asodn；pa为peiasodn增殖[1012]。因此，我们针对蛋白激酶c mrna的sd序列上游非编码区设计合成反义核酸，阻断与pkcα相关的信号通路来抑制肿瘤生长、促进其凋亡。
本实验选用肝癌常用药物5fu、 as2o3及hcpt分别与peiasodn联合使用。结果表明：化疗药物与peiasodn联合使用组的ic50最低, 分别将smmc7721细胞对5fu、 as2o3、 hcpt的敏感性分别提高到单用化疗药物4.01、1.84、2.86倍，这是由于asodn和化疗药物通过不同的机制共同作用于肝癌细胞,提高了肝癌细胞对化疗药物的敏感性所致。金正均q值法[8]分析化疗药物与反义核酸的相互作用表明: pei asodn与5fu、hcpt联合使用,均表现为协同作用;与as2o3联合使用,仅表现为相加作用，联合作用效果不如5fu、hcpt明显，原因可能是带负电荷的asodn增加了细胞膜外的电负性，影响了细胞对as2o3的摄入。而线性pei作为一种高效、低毒的阳离子聚合物,能和dna形成中性或者带正电的复合物,即pei–asodn，不仅介导asodn的摄入，而且通过中和部分细胞膜外的负电荷来促进化疗药的摄入，通过不同的机制共同作用肝癌细胞，抑制生长、促进凋亡。
肝癌属于对化疗敏感性差、耐药性强的恶性肿瘤,而肝癌患者常患肝硬化和慢性肝炎,肝功能差,不易耐受长期、大剂量的化疗。本实验通过联合使用化疗药物和peiasodn，既能减少反义核酸的使用量,又可减少化疗药物的剂量,对于肝癌治疗中减少药物的毒副作用,增强化疗药物的疗效有很好的效果。
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