作为生态安全系统的重要组成部分，土壤生态系统在微生物作用下充分发挥自身的生态功能。尤其在环境问题比较突出的背景下，生态系统稳定性很大程度上由微生物胁迫能力进行反映。因此通过通过生态系统稳定性受土壤微生物影响分析、环境胁迫影响以及土壤微生物对环境胁迫响应的关系研究响应机制具有十分重要的意义。
一、土壤生态系统稳定性受土壤微生物影响分析
在分析土壤生态系统稳定性受土壤微生物影响过程中，首先需提及微生物的多样性特征。根据以往学者分析，认为系统中的能量在发生流动或物质进行循环的过程中，微生物发挥着不可替代的作用，能够对生态系统功能进行维持。但从方法学角度，微生物影响机制受其自身多样性特点影响仍有待于明确。对此在长期研究与实践中对其多样性生命层次进行总结，具体氛围群落内生物多样性、群落之间的多样性以及不同区域所表现的多样性特点。而研究中的土壤生态系统稳定性主要指在外界环境干扰下系统能够从结构、功能等各方面保持稳定性且具有一定的恢复能力与抵抗能力。以往在土壤真菌多样性试验过程中可发现系统的稳定程度会随多样性的丰富程度逐渐升高。再如Wittebolle所研究的系统稳定性受反硝化细菌群落的影响，发现微生物均匀程度以及物种的丰富度也会产生重要的作用。
二、土壤生态系统稳定性受环境胁迫的影响分析
（一）环境胁迫中土壤微生物响应分析
对环境胁迫的概念可理解为生物体生存过程中环境所带来的压力，或生态系统在环境影响下的发展受到一定的约束，通常表现为UV-B辐射、盐碱胁迫、干旱胁迫以及冷害胁迫等。从土壤生态系统角度，其环境胁迫主要来源于土壤污染，特别在重金属污染方面，对微生物群落结构与微生物数量等造成严重影响，不利于土壤生态系统功能的发挥。也因如此，许多学者对重金属影响进行一系列分析，如针对氮循环微生物，可将土壤添加其中并培养一段时间，其中土壤在汞浓度梯度方面不同。通过试验发现硝化潜势随汞浓度的提高而逐渐减弱，证明贡胁迫下这种微生物在功能上能够自行恢复。另外，生态系统稳定性的反应也可通过微生物对一次干扰响应与二次干扰响应表现的不同特征进行反映。根据试验可发现一次胁迫与二次胁迫在因子上具有极高的相似程度，能够形成协同耐受性。而二者关系在一定条件下又表现出很大的差异，其原因在于响应上的不同。若对环境胁迫响应的类群消失后，便会出现新的类群，这些类群所表现的特征很容易对胁迫产生耐受性。
（二）以定量描述的方式分析
由前文可知，土壤微生物对其生态系统稳定性能够产生很大的影响，这就要求利用定量的方式对环境扰动与系统稳定性间的关系进行描述。其中生态系统的恢复能力与抵抗能力计算中可利用样品在环境扰动前后所表现的不同进行比较，并利用相应的计算公式如土壤间差异、土壤在扰动下的变化以及综合计算方式等。通过这种定量描述方式，微生物多样性与土壤生态系统稳定性间存在的数量关系能够得到正确的分析与判断。
三、土壤微生物对环境胁迫响应机制分析
（一）从抗性基因与微生物水平转移角度
从前文中重金属对土壤微生物的影响可分析，其恢复能力与抵抗能力的产生主要受四方面因素影响，即：第一，原有敏感性物种逐渐被耐受性物种所取代。第二，重金属中具有抗性特征的基因会发生水平转移。第三，抗性物种很可能受遗传变异的影响而出现。第四，重金属生物有效性的逐渐降低。通过一定的试验研究便可推出土壤微生物群落多样性与其自身结构很容易受抗性基因与微生物的水平转移而影响，这样环境胁迫下的微生物群落在恢复能力以及抵抗能力等方面将逐渐提高。
（二）从功能冗余角度
功能冗余常发生在土壤微生物群落中，其具体指为物种的生态功能在一定条件下可能发生重叠情况，在一类群消失后，生态系统功能会在新类群作用下仍能够保持正常状态。很多情况下，受环境扰动影响，微生物群落结构很可能发生改变，这时功能冗余的作用将充分发挥出来以确保群落的正常功能得以维持。因此有试验研究表明，尽管环境胁迫影响下微生物群落可能无法以较快的速度向其初始状态进行恢复，但生态系统不会受其变化影响。其原因在于新微生物群落与原有微生物群落存在重叠的功能冗余单元，而且群落整体水平不会受群落内部功能单元的不同受到影响，这样对土壤生态系统稳定性不会造成影响。
四、结论
在分析环境胁迫下土壤微生物的响应机制过程中，应注意结合土壤生态系统稳定性受土壤微生物影响、土壤生态系统稳定性受环境胁迫的影响分析，从而确定土壤微生物对环境胁迫响应机制。除文中所分析的响应机制外，也存在其他机制如生物细胞在环境胁迫下发生的变化等。因此实际研究过程中对响应机制的分析应不断完善，确保其能够为土壤污染修复工作提供参考依据。
参考文献：
中图分类号：G462 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02
微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。
本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于PCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。
一、变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术概述
由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGE是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGE技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链DNA分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的DNA分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的DN段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGE技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组DNA的提取；（3）DN段的PCR扩增；（4）PCR产物的DGGE分析；（5）DNA条带的序列分析。
二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和PCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGE技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中DNA的提取是影响微生物多样性的DGGE检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对DNA产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对DNA提取原理和方法的认识。通过DGGE图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。
三、小结
分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGE技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。
参考文献：
[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.
[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.
[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.
[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.
[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.
[6]王洋清，杨红军，李勇.DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.
[7]高慧琴，刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.
中图分类号：G804 文献标识码：B 文章编号：1007―3612(2006)11―1495―03
1 微流控芯片技术概述
1．1微流控芯片微型全分析系统又称为芯片实验室，是一个跨学科的新领域，是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉实现化学分析系统，从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。微流控分析芯片是微型全分析系统的主要组成部分，是以常规毛细管电泳原理为基础，通过微细加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件像集成电路一样，使它们集成在芯片材料(基片)上，实现样品进样、分离、反应乃至在片检测的微全分析系统。它以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络微结构为特征，以生命科学为目前主要应用对象。
微流控芯片的早期形式是芯片毛细管电泳。根据芯片材料的不同可分为硅芯片、玻璃芯片、石英芯片、高聚物芯片和复合材料芯片；根据功能的不同可分为高分辨分离芯片、微采样芯片、微检测芯片、细胞分析芯片、前处理芯片、化学合成芯片、多功能集成化芯片。每一个芯片实验室都将被赋予一定的功能，因此形成功能芯片系统，大体包括三个部分：一是芯片；二是信号的检测收集装置；三是包含有实现芯片功能化方法和材料的试剂盒。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀(包括主动阀和被动阀)、微泵(包括机械泵和非机械泵)；微混合器、微反应器、微通道和微检测器等。其制作工艺包括芯片的基体加工及表面加工、键合和粘接等。
微流控芯片把整个生化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，且可多次使用。因此具有广泛的适用性。微芯片分析系统的出现不仅可使珍贵的生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成百倍地提高，费用也相应下降，从而为分析测试技术的普及创造了条件。近年来，微流控芯片技术在以下几方面得到了发展：微流控分析系统从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液－液萃取、过滤、无膜扩散等多种分离手段，具有广泛的应用前景；微流控分析系统从单道检测发展到多重平行检测；微全分析系统从成分分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段；在新药物筛选中显示出强大的生命力；微流控分析系统具有多种检测手段，如电化学、质谱、原子光谱、光声光谱、化学发光等。由此可见，微流控芯片在生物化学分析中具有显著优势，这种生化检测可以提高分析速度，增加分析效率，减少样本和试剂的消耗，排除人为干扰，防止污染以及完成自动高效的重复实验。分析系统的微型化可以使野外实验室变得很简单，芯片实验室的潜在应用范围包括高效筛选、环境监测、临床监测、空间生物学、现场分析、生物战争试剂检测、高效DNA检测等。
1．2微流控芯片与基因芯片 20世界90年代初由瑞士的Manz和Widmer提出了以微机电加工技术(microelectro－mechanical systems，MEMS)为基础的“微型全分析系统”(micrototal analysis systems，μTAS)。μTAS可以分为芯片式与非芯片式两大类，其目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度的把分析实验室的供能转移到便携式的分析设备中。目前，芯片式是发展的重点，即最大限度地把分析实验室的供能集成到方寸大小的芯片上，实现所谓的“芯片实验室”(lab-on a-chip，IDC)。在芯片式μTAS中，依据芯片结构及工作原理又可以分为微阵列芯片和微流控芯片。微阵列芯片目前的应用对象是DNA分析，也称DNA芯片、基因芯片或生物芯片。生物芯片技术的实施包含三个基本元素：1)生物探针分子的获得；2)探针分子的表面固定和对样品的识别；3)识别结果的检测和分析。有关基础研究始于20世纪80年代末，主要是在生物遗传学领域发展起来的。而微流控分析芯片是1990年提出的μTAS主要发展方向，主要是在分析化学领域发展起来的。在目前的学术刊物中，微全分析系统(μTAS)和微流控芯片(microfluidic chip)指的是同一个概念。其目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在可多次使用的微芯片上。因此较微阵列芯片应有更广泛的适用性及应用前景。
1．3微流控芯片的应用 目前微流控芯片已突破其发展初期在加工技术即基本流控技术上的主要难关，正在进入一个开展更深入的基础研究、广泛扩大应用领域，及深度产业化的转折时期。这种微型化、集成化的微流控芯片氨基酸和蛋白质的分离、免疫分析、DNA分析和测序、生物细胞研究等方面显示出巨大的潜力。这必将对疾病诊断和治疗、新药开发、食品卫生等诸多领域产生革命性的影响。
1．3．1蛋白质分析 微流控芯片的一个重要的应用领域是蛋白质。蛋白质的微流控电泳芯片，通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、微阀、微电泳以及微流路，可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上，然后在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类。除了蛋白质以外，对更为复杂的糖蛋白的芯片测定也已开始，用电泳技术结合蛋白酶和糖苷酶对蛋白质的处理，在芯片实验室进行糖蛋白中糖链分析的方法已建立。徐良基等利用微流控芯片技术制作石英玻璃材料的微流控芯片，在自行研制的紫外可见吸收检测系统上，实现了芯片上对牛血清蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG和人转铁蛋白TRF及它们的混合溶液的分离检测，结果重复性较好。王惠民等依据电荷和分子量的不同，利用微流控芯片技术，在2～3 min内检测到38例尿蛋白阳性患者中，溢出性蛋白尿3例、选择性蛋白尿9例、非选择性蛋白尿26例，8例健康对照未检出蛋白峰。
1．3．2免疫分析免疫分析是利用抗原和抗体之间的特异性反应来选择性识别和测定作为抗体或抗原的待测物。经过多年的应用与发展，免疫分析已经成为临床诊断、生物医药以及环境化学研究中一种有力的分析手段。降低样品和试剂的消耗量，提高分析速度是免疫分析的重要目标。在微流控芯片上进行免疫分析是对毛细管电泳免疫分析技术的重大革新。这种微片装置是在微型的玻璃片或者硅芯片上采用化学刻蚀等技术产生一些微小的通道来代替传统的毛细管作为电
泳分析的场所。这种开放式的通道结构使得在很短的分析长度内就可以满足分析需求，可以大大缩短整个分析所需的时间，并可根据实际需要设计合适的芯片。芯片上可以很容易地刻蚀上很密集的分析通道的阵列，并可高精度地复制生产，大大增加了分析通量。因此，免疫分析在微流体系统中的应用已受到广泛的关注。
1．3．3 DNA分析及测序 微流控芯片可用于迅速分离DNA限制性片段PCR产物，比常规的毛细管电泳分离要快得多。把β珠蛋白的PCR扩增反应缩微集成到硅芯片上，目的基因进行15 min的扩增，然后仅用2 min就可完成PCR产物的分离，整个分析过程不到20 min。混合样品多PCR产物电泳芯片分离，可同时分析10个以上PCR反应产物，尤其适用于基因作图分析，以及遗传性疾病诊断。在微流控芯片上观察荧光标记DNA的重复三联体序列，分离速度是常规毛细管电泳的十几倍。此外，常规DNA测序需要制备微升级的样品，试剂消耗量大。将纳升级的样品制备系统缩微到芯片上进行测序，可在分离前除去多余的引物、盐分、核苷酸等，所用测序体积是Sanger双脱氧链终止法的1／300，测序成本明显降低，而且可进行固相测序。将微流控芯片四色标记法用于DNA测序，可在540 s分离150个碱基，准确率在97％以上。用高分子材料制作的微流控－微阵列芯片，可以用于核酸杂交并对其进行实时检测。而且微流控－微阵列体系还可以检测杂交反应的动力学特性。
1．3．4细胞培养与检测单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗和药物筛选以及细胞生理、病理过程的研究有重要意义。微流控分析芯片的网络结构和微米级的通道尺寸使简化单细胞分析成为可能。微流控芯片系统用于细胞分析是近年来该技术发展的一个热点，已引起较广泛的关注。利用微全分析系统高度微型化、集成化和设计灵活等特点，通过巧妙设计和精密加工能够实现细胞的培养、凋亡及检测等功能，如细胞操作，绿色荧光蛋白的表达，基因转染，细胞活性测试，细胞分离，细胞内钙离子的测量，激素分泌监测以及高通量的细胞含量分析等。目前，微流控：片系统已被应用在血液流变学、单细胞操纵与计数以及单细胞胞内组分分析等多方面。在微流控芯片通道中，人们利用气压、液压和电压，或利用介电电泳、光学陷阱、行波介电电泳以及磁场等技术，可以操纵细胞通过或驻留在通道内的任意位置，从而使单细胞计数、筛选以及胞内组分分析等操作大大简化。
1．3．5药物筛选 药物筛选是现阶段新药开发的主要途径。高通量药物筛选是近10年来发展起来的药物筛选的新的技术体系。微流控芯片实验室实现药物筛选的基本原理是以酶标为例，即令酶和一种荧光标记的底物反应，使之产生一种荧光产物，用芯片电泳将这一荧光产物和荧光底物或其他荧光本底分离开来。这种方法已经用于蛋白激酶．磷酸酶、蛋白酶、细胞色素和磷酸单脂酶等，芯片上的分离只需几秒，通常变异系数小于10％。用于药物筛选微流控芯片装置有两大类，一类是一次性使用芯片，它采用类似于喷墨打印机的微散射法，把样品和试剂注入芯片的一组通道；另一种以连续流法为基础，它将样品的注射过程、混合过程和功能实现过程在芯片上集成于一体。
微流控装置的用途广泛，但目前流行的微流控装置最大的不足之处是它们需要大量辅助的外部设备，体积庞大且成本很高，这就极大地限制了它的应用。克服这些困难的一个途径就是将所需试剂装配并存储于微流控体系内部，真正实现“lab-on-a-chip”。有学者预计，最晚到2008年，以微流控芯片为核心的微分析系统将取代当前化学分析实验室的很多设备，使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭。在此基础上再经过三五年，能监测自身生化指标及基因变异、食品卫生及环境状况的便携式“个人化实验室”将可能成为现实。
2 微流控芯片技术与体育科技研究
中国自1984年重返奥运大家庭以来，在奥运会上取得了喜人的成绩。这些成绩的取得与科研人员参与到运动队中开展科研攻关与科技服务，大大提升科学化训练的水平密切相关。在总结了以往开展科研攻关与科技服务经验的基础上，针对运动员在训练比赛中遇到具有共性和基础性的问题，在新的一个备战奥运会周期中，提出了10个领域的科研工作，即运动员科学选材、运动训练科学化理论与方法的研究与应用、优秀运动员训练监控和机能评定的研究与应用、运动员体能恢复与营养补充的研究及应用、运动员心理咨询和心理训练理论与方法的研究及应用、运动创伤与医务监督的研究与应用、中医药防治运动性疲劳及伤病的研究与应用、反兴奋剂的研究与应用、体育信息与服务的研究与应用、竞技体育综合管理及战略研究。其中，在运动人体科学领域涉及的主要的热点问题有，运动损伤的防治、运动性低血睾酮、运动性低血色素(运动性贫血)、运动性免疫机能低下等的发生机理的研究，以及兴奋剂检测方法的研究，等等。
随着教练员、运动员文化素质的提高和运动训练基地科研条件的改善，借助科技手段辅助训练日益被教练员、运动员所接受，甚至有些教练员已经开始尝试根据科研人员的科学检测报告制订训练计划。事实上，对训练进行科学监控已成为当今运动训练(科学)的重要组成部分。目前，常用辅助教练员开展训练、评价运动员体能的指标有，血睾酮、皮质醇、血乳酸、血红蛋白、红细胞谷胱甘肽和活性氧、血清肌酸激酶、血尿素、IgN、IgA、IgG等，其中，监测血睾酮、皮质醇、红细胞谷胱甘肽和活性氧等通常须要采集受试者的静脉血，用分离出的血清与红细胞才能完成监测。然而，运动员和教练员往往不愿接受静脉取血，因此，研发微创、微量(采集末梢血)、快速的分析方法检测生化指标，现场化、及时性地评价运动员体能具有重要的意义，相关方法的研究亟待解决。
根据微流控芯片实验室所需样品微量，更具高通量、高效率、短时间等优势，中国科学院林秉承等与我们合作，利用微流控芯片技术进行了血睾酮和皮质醇联合检测芯片，血睾酮、皮质醇联合检测芯片分析仪的研发，目前该工作已完成标准品的检测。如果能够充分发挥微流控芯片技术的优势，研发出不需要用常规的静脉取血分离血清检测的方法，而是以末梢微量全血为直接的检测样品的芯片检测系统，建立通过微量的末梢血就可以快速、准确地完成多项指标的同时检测的运动员体能监控的微创检测方法，那么这将是一个“质”的飞跃。这个飞跃不仅仅会体现在检测方法上，也一定会体现在提高运动员体能上。如果能将这种技术推广应用，必将受到体育科技人员、乃至运动员和教练员的普遍欢迎，具有广阔的市场前景。
前言：作为集环境监测、环境工程、保护学以及微生物学于一体的学科，微生物学在不断发展中逐渐衍生出较多亟待解决的问题。尽管近年来有较多先进理念与技术被引入该学科中，但对于部分环境监测或环境净化等问题，所取得的效果并不理想，要求充分发挥分子生物技术的优势。因此，本文对环境工程微生物中分子微生物技术的应用分析，具有十分重要的意义。
1分子生物技术的相关概述
1.1测序技术
细胞中的rDNA本身表现出明显的高突序列、保守序列以及稳定特征，但其是分类微生物中的指标之一。通常测序分析中，为使微生物种群得以分析，对分离物或分类单元进行确定，便需借助rRNA分析方式。从该基因序列的类型看，有较多如16SrRNA、23SrRNA与5sRNA，其中后两者包含的含核苷酸分别过多与过少，很难为测序分析提供指导。所以在原核生物系统研究中，可考虑将16SrRNA引入。具体测定中，会在如TA克隆试剂、PGEM-T克隆试剂等载体应用下，克隆PCR产物，完成文库构建过程，在此基础上结合16SrRNA基因测序结果，可通过其与文库中的序列做好对比，判断是否有相对应或相似微生物种类。另外，也可对rDNA多样性利用电泳分离进行显示，或直接通过RFLP对扩增产物做好分析。通过这些测序方法的应用，对微生物系统发育的研究可起到重要作用[1]。
1.2核酸技术
核酸技术在分子生物技术中极为常见，可具体细化为PCR-SSCP、PCR-DGGE与PCR-RFLP等技术。以其中PCR-SSCP技术为例，其以往运用中多局限在基因突变方面，是临床医学中的常用方法，经过不断发展被引入到微生物生态学中。从其实现原理看，主要以单链DNA空间折叠构象为基础，若其中有碱基出现变化，空间构象会随之发生变化，配合聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，使DNA谱带得以生成。以16SrRNA测序在废水生物中的表现为例，便可借助PCR-SSCP，对细菌群落受培养基变化的影响进行分析。再如PCR-DGGE，应用中一般强调将基因组DNA从环境样品内被提取，在此基础上将PCR扩增技术引入，可达到扩增DNA的目标，此时可将聚丙烯酰胺凝胶与扩增产物相结合，通过电泳作用分离双链DN段，最终生成的将为单链DNA谱带。最后便可对谱带中展现的碱基序列与文库内序列做好对比分析，完成微生物种属的界定。由于该技术具有较好的分离效果，操作较为简便，所以在微生物分析中的应用较为常见，如对微生物种群在活性污泥中的情况判断，将该技术引入，可起到良好的效果。另外，在PCR-RFLP技术方面，其主要借助核酸特异位点、DNA识别序列，对双链DNA进行切割，配合溴化乙锭凝胶的应用，无需通过放射性标记形式，便可达到DN段分析目标。如土壤中微生物的判断，便可借助该技术实现。
1.3基因探针
目前分子生物技术中，基因探针的引入主要借助荧光染料、放射性同位素，对样品内核酸进行识别分析。对于该技术，也表现在核酸印迹、荧光原位以及放射性标记探针等技术方面。其中放射性探针应用下，尽管对于寡核苷酸、RNA或单链DNA等都可进行标记，但其涉及的同位素具有较高的成本，很容易危害人体健康，所以使用中受到较大的限制。而对于荧光原位，应用中一般可做好细菌空间位置标识或定量定性判断细菌情况等工作。另外，在核酸印迹方面，其适用对象集中表现在PCR扩增产物方面，对微生物风度、多样性检测都可起到重要作用[2]。
2环境工程微生物领域中分子生物技术的应用分析
2.1微生物群种丰度与多样性的分析
现行环境工程领域中，通常需检测的对象多表现在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。从现行较多实践研究都可发现，若将16SrRNA从菌落中提取出来并开展测序工作，可对微生物种群在活性污泥中的情况被测定，并将聚光激光扫描、荧光显微以及FISH等技术引入，可定位生物膜中的微生物或检测其活性。再以城市地区垃圾填埋细菌的分析，可在ARDRA方法的运用下，使细菌多样性情况以及细菌结构被有效判断。这些都可充分说明微生物丰度、多样性都可在分子微生物技术应用下被有效判断，通过定量或定性检测得到的结果，能够为环境工程中较多工艺操作、构筑物设计提供参考。
2.2指示微生物与致病菌的有效检测
环境工程研究中，可发现在土壤、水体或空气等媒介作用下，致病菌很可能对人体造成较大威胁，如典型的SARS。对此，便可借助分子微生物完成致病菌测定工作，如部分学者将16SrRNA基因、PRC-DGGE技术共同引入，对垃圾场、污水处理厂以及大学校园中的空气环境进行测定，可发现在以往微生物培养下，很难测定气溶胶微生物情况。另外，对于水体内是否有大肠杆菌等DNA存在，也可借助分子微生物技术进行判断。这些都可充分说明，对于指示微生物、致病菌的检测，分子生物技术应用效果都较为明显。
2.3功能微生物的培养
由于当前化工行业发展步伐较快，其带来的过多有机化合物也成为环境工程领域面临的难题，很多有机化合物如含苯环类型，很难实现快速降解目标。对此问题，大多学者通过实验方式，发现分子生物技术应用下可使这种现状得以改变，如对甲苯质粒、降解萘利用DNA印迹杂交形式，可使这两种质粒微生物被判断。此外，对于其他难以降解的有机物，都可采用质粒如工程、基因重组等方式，使功能群被构建，使有机物难以被降解的问题得以解决[3]。
3结论
分子生物技术的应用是现行微生物研究的重要保障。实际引入该技术中，应正确认识分子生物技术的实现原理，包括测序技术、基因探针以及核酸技术等，在此基础上将其融入致病菌检测、功能微生物培养以及微生物多样性分析等方面，能够推动环境工程微生物学的进一步发展。
参考文献
[1]石琛,王璐.环境微生物领域分子生物技术的应用进展[J].中国科技信息,2013,16:135+139.
1固相微萃取
固相微萃取(Solid-phasemicroextraction,SPME)是一项新型的无溶剂化样品前处理技术。固相微萃取以特定的固体（一般为纤维状萃取材料）作为固相提取器将其浸入样品溶液或顶空提取，然后直接进行GC、HPLC等分析。SPME由Pawliszyn在1989年首次报道，近10年来固相微萃取技术已成功应用于气体，液体及固体样品的前处理。
1.1固相微萃取技术及原理
固相微萃取法是以固相萃取为基础发展起来的方法，固相微萃取利用了固相萃取吸附的几何效应，其装置结构的超微化决定了它能避开经典固相萃取的许多弱点。固相微萃取技术多在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(萃取头)，再将萃取头直接浸入样品溶液(直接浸没－固相微萃取方法，简称DI－SPME)或采用顶空－固相微萃取方法(HS－SPME)采样。由于聚合物涂层的种类很多，因而可对样品组分进行选择性富集和采集。固相微萃取的原理是一个基于待测物质在样品及萃取涂层中分配平衡的萃取过程。
固相微萃取利用表面未涂渍或涂渍吸附剂的熔融石英纤维或其它纤维材料作为固定相，当涂渍纤维暴露于样品时，根据“相似相溶”原理，水中或溶液中的有机物以及挥发性物质，从试样基质中扩散吸附在萃取纤维上逐渐浓缩富集。萃取时，被测物的分布受其在样品基质和萃取介质中的分配平衡所控制，被萃取量(n)与其他因素的关系可以用下式描述：
n=kVfC0Vs/（kVf+Vs）
式中：k为被测物在基质和涂层间的分配系数，Vf和Vs分别为涂层和样品的体积，C0为被测物在样品中的浓度。如果样品体积很大时(Vs>>kVf)上式可以简化成：
n=kVfC0
萃取的被测物量与样品的体积无关，而与其浓度呈线性关系，因而从分析结果中得到的萃取纤维表面的吸附量，就能算出被萃取物在样品中的含量，可方便地进行定量分析。
1.2固相微萃取操作条件的选择
萃取头的构成应由萃取组分的分配系数、极性、沸点等参数来确定，在同一个样品中，因萃取头的不同可使其中一个组分得到最佳萃取而使其他组分受到抑制。平衡时间往往由众多因素所决定，如分配系数、物质扩散速度、样品基质等。此外，温度、离子浓度、样品的搅拌效率和pH值等因素都可影响萃取效率。
1.3影响固相微萃取萃取率的因素
1.3.1萃取头的种类及膜厚
固相微萃取的核心部分－萃取头材料特性或涂层的种类和厚度对灵敏度的影响最为关键，因此，对其选择要十分慎重。
目前，世界上已有七种商品萃取头问世，固定相可分为非键合型、键合型、部分交联型以及交联型四种。非键合型固定相对于某些水溶性有机溶剂是稳定的，但是当使用非极性有机溶剂时会引起轻度溶胀现象。对于键合型固定相，除了某些非极性溶剂以外，对所有的有机溶剂均很稳定。部分交联型固定相在大多数水溶性有机溶剂和某些非极性有机溶剂中很稳定。高度交联固定相类似于部分交联固定相，只不过在同一交联中心产生了多个交联键。
最常用的也是最早使用的高分子涂层材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PA)。其中，100μm的PDMS适用于分析低沸点、低极性物质，7μm的PDMS适用于分析中沸点及高沸点物质，PA适用于分析强极性物质。以后，又陆续出现了聚酰亚胺、聚乙二醇等涂层材料。混合固定相应用也较广泛，如聚乙二醇——膜板树脂，聚乙二醇——二乙烯基苯，聚二甲基硅氧烷——模板树脂以及环糊精等。为了开发聚合物的导电性质，一些科学家还尝试用聚砒咯涂层来萃取极性甚至离子型待测物。此外，还开发了纤维双液相涂层，它可以克服单一液相涂层萃取有机化合物范围狭窄的缺点，萃取范围更广，是目前研究和发展的趋势和方向。萃取头涂层越厚，对待测物吸附量越大，可降低最低检出限。但涂层越厚，所需平衡萃取时间越长，使分析速度减慢。因此，应综合考虑各种情况。
1.3.2萃取时间
萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，出现一转折点后上升就很缓慢。因此，可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同，适当缩短萃取时间。
1.3.3搅拌和加热
在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化，缩短平衡时间。对顶空固相微萃取(HS－SPME)加热可提高液面上易挥发有机化合物的浓度，而提高萃取效率。
1.3.4无机盐
向样品中加入(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl和K2CO3等无机盐可降低有机化合物与基质的亲和力而提高萃取效率。
1.3.5pH缓冲溶液
萃取酸性或碱性物质时，通过调节样品的pH值可改善组分的亲脂性，从而大大提高萃取效率。
1.4固相微萃取操作模式
根据被分析样品的物理性质和状态，进行固相微萃取时可以采取不同的操作方式，常见的操作方式有如下三种。
1.4.1固相微萃取直接法
将固相微萃取的纤维头直接浸入水相或暴露于气体中进行萃取的方法称为SPME直接法，对于气体样品或较干净的水样，能在1min内迅速达到萃取平衡，因而常使用直接固相微萃取模式。
1.4.2顶空固相微萃取法
把萃取头置于待分析物样品的上部空间进行萃取的方法叫做固相微萃取顶空法。这种方法只适于被分析物容易逸出样品进入上部空间的挥发性分析物，对黏度大的废水、体液、泥浆或固体样品，则只能采用上空取样的顶空固相微萃取模式，萃取从基质中释放到样品上空的化合物。
1.4.3衍生化固相微萃取法
通过衍生化作用来降低极性化合物的极性后进行固相微萃取的方法叫做衍生化固相微萃取法，极性化合物通过在其水溶液基质中加入衍生剂或将纤维涂层浸入适当的衍生化试剂被衍生后进行萃取，衍生化后极性分析物极性降低，萃取后更适于色谱分析。
1.5固相微萃取与其它分析方法相结合
固相微萃取萃取待测物可与气相色谱(GC)、液相色谱(LC)等分析分离技术联用进行分离。使用的检测器可以是质谱(MS)、氢火焰离子化检测器(FID)、火焰光度检测器(EPD)、电子捕获检测器(ECD)、原子发射光谱检测器(AED)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)以及离子淌度谱仪等。
1.6固相微萃取的应用
1.6.1固相微萃取在有机金属形态分析中的应用
样品预处理对于得到准确而又重现性好的分析结果非常重要。在进行形态分析时，为保证样品中各种形态在样品预处理过程中不发生变化，一般需要采用较为温和的消化或浸提的方法将待测有机金属化合物释放到液相中，常用的有酸／碱(常用HC1)浸提、微波或超声波辅助消化、CO2超临界流体萃取等技术，浸提法简便但结果的准确性难以考证，后几种方法需要借助于其它仪器，操作不便，费用较高。固相微萃取用于样品中金属及有机金属形态分析是最近几年才开始，其应用具有很大的潜力。
将SPME用于有机金属的分析最早是由CaiY等人于1994年在第十六届国际毛细管色谱大会上提出的，将SPME用于鱼体和水样中汞及水体中的有机锡的萃取，降低了测定的检测限，但精密度差，RSD在24.1～68.8之间。1995年报导了汞及甲基汞中加人四乙基硼化钠衍生，而后由SPME萃取，GC－MS进行测定的方法。从此，SPME用于各种有机金属的萃取方法逐渐建立。
Tutschku等研究了环境样品中有机锡和有机铅的萃取方法，TadeuszGorecki和JanuszPawliszyn用SPME－GC测定了水中四乙基铅及无机物。Dumemann等人将SPME用于烷基铅、汞、锡的分离，样品被消化和分解后加入四乙基硼化钠衍生(pH值在4～5)以提高分析物的挥发性，10min后室温下将SPME萃取头放在样品的上部空间。Mester和Pawlisyzn将SPME萃取头直接浸入样品溶液，对尿液中的一甲基肿和二甲基肿进行了分析。
1.6.2在天然产物分析中的应用
对于分析中草药及中药材中的挥发性成分来说，SPME是一种很有用的方法。在中药分析方面，马长华等人使用固相微萃取技术测定中药石菖蒲中挥发性成分并鉴定出16种化合物。运用HS－SPME－GC－MS方法可从新鲜的紫苏中鉴定出20多种挥发性成分。刘百战等使用HS－SPME－GC－MS方法分离栀子鲜花头香成分，并鉴定了54种化学成分。Miller等测定了肉桂中的香豆素、醋酸桂皮酯、石竹烯、2－甲氧桂皮醛等成分，以此来确定肉桂类植物的植物学起源及鉴别。Winkle等人使用技术分析了人工麝香的水溶液。使用SPME技术可从冷杉叶中提取挥发性成分，以及蛇麻草中的各种挥发性成分。Schafer等人应用HS－SPME分析了针叶松叶中的蒎烯、樟烯、月桂烯等单萜类成分。应用HS－SPME法可萃取脱氧麻黄碱及其主要代谢产物苯异丙胺，方法快速、灵敏、准确，可避免常用测定方法所遇到的干扰。PDMS纤维可从中药丸中顶空萃取出17种萜类化合物。
在天然香料分析方面，刘扬岷等用SPME－GC－MS分析白兰花的香气成分，分离了114个色谱峰并鉴定了其中的75个成分。An等人使用HS－SPME－GC－MS方法从新鲜的熏衣草中分离测定了香气成分。Jan等人从青霉菌和尼日尔黑霉菌的表面测定到了经过生物转化的柠檬醛、香叶醇和橙花醇。
SPME技术可以用于从食品中提取分析组分。SPME技术可检测曲奇饼上薄荷油的含量，薄荷油中基本的成分是薄荷醇，前处理简单而干扰较少。Garcl等人对葡萄酒中的酒香组分进行了分析，建立了固相微萃取(SPME)和甲基硅烷化结合新的样品预处理方法，并应用气相色谱——质谱联用技术对葡萄酒中极性有机物进行了分析，对其中的白藜芦醇苷进行了定量分析，方法简单快速，灵敏度高。Hmenryk等人用HS－SPME技术(用PA作液相)与静态顶空法(SHS)对比研究啤酒的香味物质发现，对于低浓度的香味化合物，二种方法都具有较高的可重复性，与啤酒香味的分析结果也高度相关。1996年Coleman用SPME提取mailard反应产物中的香味成分，检测灵敏度可达ng/L级水平。Clark等采用HS－SPME技术分析了烤烟、白肋烟、马里兰烟的顶空挥发物。衍生化法是用于分析极性较强的半挥发、不挥发有机物。Lin等人进行了衍生化SPME－GC联用萃取水样中的脂肪酸，待测物为乙酸、丙酸、辛酸等11种脂肪酸，衍生试剂为芘基重氮甲烷。实验结果为衍生化SPME对含较长碳链的(C6～C10)脂肪酸检测限为pg/L级，对含较短链的(C2～C4)的脂肪酸在ng/L级。如果在涂层上完成衍生化反应，则检测限还可以进一步降低。
1.6.3在医学中的应用
随着SPME与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断发展和成熟，SPME正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。
（1）基础医学中的应用。
随着固相微萃取技术的广泛应用，必将会对生理、病理、毒理学等基础医学的研究和发展起着较大的推动作用，如应用SPME检测人体体液中抗组胺类化合物以及细菌代谢产物等。RalfEiscrt等采用管内自动SPME－HPLC联用与强极性萃取涂层和手性涂层分别对多种维生素和手性药物进行了分析。Lillian等对人体尿液、血液和乳汁中的单环芳香胺(monocyclearomaticamines)及芳香胺(aromaticamine)的代谢产物进行了研究，认为这些检材可以用作生物监测指标。这必将在预防医学特别是职业病防治方面发挥重要作用。
（2）在临床医学中的应用。
随着SPME与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断发展和成熟，SPME正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。
（3）在法医学中的应用。
由于法医毒(药)物分析所用检材的特殊性和复杂性，自1993年美国Supelco公司推出商品化的SPME装置后，SPME就很快应用到毒物分析中。ChristophGrote等就曾用SPME－GC－MS通过测定呼出气体中乙醇含量而可以换算出血液中乙醇含量10min内便可以完成。如果将SPME－GC便携仪用于酒后驾车肇事现场检测，必将给交通事故的处理带来极大的方便。目前,SPME已成功的分析了血液、尿液、脏器组织等生物检材中的毒鼠强、氰化物、有机磷农药、乙醇、麻醉剂等。Watanabe等人应用顶空——固相微萃取——气相色谱——质谱联用的方法(HS－SPME－GC－MS)分析血液中的5种麻醉剂，该方法已成功地应用到法医学鉴定中。
1.6.4SPME在环境分析中的应用
在应用研究领域，大量学者将SPME技术应用于各个分析领域，对大量的待测物质进行了分析测定，得到了令人满意的分析结果。其中又以其在环境分析中的应用最多，主要有：
在气态样品的分析方面：研究者对空气中的BTEX类化合物，甲醛，胺类物质，石油烃化合物等进行了分析研究。而GorloDanuta等人通过利用SPME－GC－MS方法对几种有机污染物的分析，建立了一种评估室内空气质量的方法。
在液态样品的分析方面：主要用于分析水中的有机氯化台物，BTEX类化合物，脂肪酸及脂肪酸盐，15种甘油醚，氯苯类化合物，杀虫剂，环境水样中的有机磷农药和除草剂等。我国的李攻科等人利用SPME－GC－MS联用检测了赤潮海水中的有机物，研究了其种类和含量的变化规律。陈文锐等人用SPME技术代替传统的进样技术，对污染棕桐油中的低浓度二甲苯进行了测定。此外，对水中和沉积物中的有机金属化合物的分析也有大量报道。
在固态样品的分析方面：土壤样品中的氯代苯，对三嗪在沉积物中的吸附系数的测定，固体样中的卤代苯，卤代酚，污泥及沉积物中脂肪酸与洗涤剂组分，纺织品及皮革品中的禁用偶氨染料的测定。
参考文献
［1］ArthurC.L.,PawliszynJ.,Anal.Chem.,1990,62:2145.
［2］StephenJ.E.,DonaidS.M.,EvaH.J.,Chromatography,2000,905:233-240.
［3］HighResol,Chromatogr.,1995,18（9）:535-539.
［4］GoreckiT.,PawliszynJ.,Anal.Chem.,1995,67:3265-3274.
［5］Chem.J.,PawliszynJ.,Ana1.Chem.,1996,67:2530-2533.
［6］EisertR.,PawliszynJ.,Ana1.Chem.,1999,69:3140-3147.
［7］TutschkuS,MothesS,Wennrich,R.Fresenius,Anal.Chem,1996,354:587-591.
［8］TadeuszGorecki,JanuszPawliszyn,Anal.Chem.,1996,68:3008-3014.
［9］LotharDulnemann,HosseinHajimiragha,JuttaBegerow,Fresenius,Anal.Chem.，1999，363:466-468.
［10］MesterZ.,PawliszynJ.,J.Chromatogr.,PartA.,2000,873(1):129-135.
［11］MillerK.C.,PooleC.F.,PawlowskiT.M.,Charomatographia,1996,42:639.
[中图分类号] TE991 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2013）-10-185-2
1引言（Introduction）
生物修复是消除石油烃和其他烃类污染物的基本途径之一（Harayama et al.，2004）。研究显示含油污水灌溉刺激了稻田土壤中好氧异养细菌（AHB）和真菌的生长（李慧等，2005）。石油烃浓度较低时可以促进油菜生长，但是严重影响土壤中的微生物种类数量（李洪梅等，2010）。因此，研究石油污染土壤中微生物的群落结构特征的变化具有重要的理论和现实意义。
磷脂脂肪酸分析技术是一种不需要经过培养就能获得用于原位微生物群落结构的方法。磷脂脂肪酸（PLFAs）存在于活细胞的细胞膜中，在细胞死亡后很快被分解，因此其含量能反映微生物的活性。不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的PLFAs（Wu，2006），具有属的特异性。其组成及含量显示出极大的差异，可用来直接估价其微生物的生物量及群落结构，是一种较为准确、有效的研究方法（Zelles，1994；Guckert，1986）。本文以黄浦江-长江口沿岸湿地为研究区，选择土著植物草、香附子、茭白、芦苇为供试植物，采集根际土壤，分析不同植物根际土壤的微生物群落结构，并在实验室模拟条件下，研究柴油污染对根际土壤微生物群落结构的影响，探讨石油污染土壤中根际微生群落的变化及生物降解效应。来评价石油烃污染土壤的植物修复可行性，为油污湿地植物修复提供理论和技术支持。
2材料与方法（Materials and methods）
2.1样品采集与处理
研究样品采自黄浦江-长江口江岸湿地（N31°23’，E121°30’），草（Scirpus tripueter）、香附子（Cyperus rotundus）、茭白（Zizania latifolia）与芦苇（Phragmites australis）是该区标志性植物群种。采样样品采集选择以上四种代表性植物，采集粘附或紧临根系的土样及没有植物生长的样品，取样深度5～20cm。挑除土壤样品中较大的杂质后，真空冷冻干燥后，过孔径
2.2模拟实验设计
模拟实验采用50mL锥形瓶，分别加入20g根际土和20g油污土，混合后加入无菌蒸馏水补充水分，不在添加营养物质，并加入0.64g柴油作为污染物，使混合土壤中的TPH含量为16000mg/kg。28℃避光静置培养14d，培养结束后，冷冻干燥。
2.3测定方法
2.3.1微生物活性
各种植物根系土壤的微生物活性以荧光素双醋酸酯（FDA）法测定（俞毓馨等，1990）。结果表示为abs・（g.2h）-1（干重），以此来量化土壤中微生物活性。
2.3.2PLFA的提取
采用稍加修改的Bligh和Dyer法提取和分析PLFA（Bligh and Dyer，1959）：称取3g冷冻干燥的土样，以混合单相提取剂（氯仿：甲醇：柠檬酸比为1：2：0.8，v/v）提取，固相萃取分离磷脂。温和碱性甲酯化生成脂肪酸甲酯，进行GC-MS分析。
2.4数据处理
研究结果为3次重复实验的平均值，采用Excel 2003和SPSS 17.0软件进行单因子方差分析（One-way ANOVA）（李志辉等，2003）。
3结果与讨论（Results and discussion）
3.1柴油对微生物活性的影响
本实验中原始的5种土样中草根际的微生物活性最高，高于其他土样0.1abs・（g.2h）-1以上。而土样之间微生物活性差别不大，无论是根际与非根际土，还是不同植物的根际土之间均无显著性差异（P
3.2柴油对土壤PLFA组成的影响
各种土壤样品中共鉴定出磷脂脂肪酸29种，碳链长度从12到24，包括饱和、不饱和及支链脂肪酸。其中11种PLFA（i14：0、14：0、i15：0、15：0、16：1ω7c、16：0、i17：0、17：0、18：0、i20：0、22：0）在5种原始土样中均被检测到，5种原始土样中分别检测到20、19、22、22和21种单体PLFA，并未表现出明显的差异，与微生物活性的分析结果一致。在各种PLFA中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占大多数，含量占总量的80%以上，其中12：0、16：0和16：1ω7c是主要的单体PLFA，根际土壤中单不饱和脂肪酸的比例显著高于非根际土壤（P
分析PLFA的种类可以发现，受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P
比较生物多样性指数可知，柴油对土壤PLFA多样性产生显著影响，无植物土壤中PLFA多样性仅为胁迫前的1/3。不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P
3.3柴油对土壤微生物群落结构的影响
由于不同微生物体酶系不同，致使不同的生物体遗传有特定脂肪酸，因此特征脂肪酸是不同微生物类群的生物标志物，某些脂肪酸的比值是反映微生物群落结构特征的重要依据（Soderberg，2004）。
分析实验结果，各种特征脂肪酸的含量在不同原始土样中存在显著差异（P
比较柴油胁迫前后土样征脂肪酸的变化可以发现，除芦苇根际土壤外，受胁迫后的土壤征脂肪酸含量显著降低（P
比较受胁迫后的不同土样，可以发现不同土样中的特征脂肪酸含量存在显著性差异（P
4结论（Conclusions）
本文研究了柴油短期胁迫对黄浦江-长江口沿岸湿地研究区土壤微生物群落的影响，研究证明柴油胁迫明显改变了土壤微生物群落结构：
（1）原始的5种土样中草根际的微生物活性最高，其他土样之间无显著性差异（P
（2）受到柴油胁迫后土壤中PLFA的种类明显减少，其中无植物土壤受到的影响最为明显，而芦苇根际土壤受柴油影响较小。受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P
（3）土壤PLFA多样性指数分析显示，不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P
参考文献
[1]陈嫣，李广贺，张旭等.2005.石油污染土壤植物根际微生态环境与降解效应[J].清华大学学报（自然科学版），45（6）：784～787.
[2]李洪梅，郜玉环，江丽华等.2010.不同浓度石油烃对油菜产量、土壤中石油烃残留量及土壤微生物的影响[J].中国农学通报.26（17）：382～385.
[3]李慧，陈冠雄，杨涛等.2005.沈抚灌区含油污水灌溉对稻田土壤微生物种群及土壤酶活性的影响[J].应用生态学报.16（7）：1355～1359.
[4]林学政，沈继红，刘克斋等.2005.种植盐地碱蓬修复滨海盐渍土效果的研究.海洋科学进展.23（1）：65～69.
传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技术为代表的生物化学方法，以BIOLOG技术为代表的生理学方法和基于DNA多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。 1土壤功能微生物SIP鉴定技术流程 SIP技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的DNA或RNA等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15N和18O为基础的SIP技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。 1.1土壤SIP技术前处理方法选择 SIP技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证DNA/RNA的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要为两种：一种是PLFAs法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态FAME，提取的脂肪酸种类仅有El-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是TSFAMEs法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接PLFAs，多为真菌所特有[9]。 1.2土壤SIP技术中生物标志物的选择 土壤SIP技术定微生物的生物标志物为PLFA、DNA和RNA3种。PLFA-SIP法是将PLFA从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过PLFA图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种PLFA中13C的丰度[7]。PLFA-SIP的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知PLFA分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可获得更直接的功能微生物遗传信息。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，DNA完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。DNA-SIP的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺点。自然环境定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。因此，RNA-SIP能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的结合将会大大提升SIP技术的潜力。 1.3土壤SIP分离后的分析方法 13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的DNA/RNA进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量PCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的DNA/RNA分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量PCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量PCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了SIP技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组DNA可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRNA基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定SIP技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRNA基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避PCR扩增，直接对标记13C-RNA测序，每次分析可获得大约100万16SrRNA基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物DNA序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。#p#分页标题#e# 1.4构建克隆文库 超高速密度梯度离心分离并鉴别13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文库，构建遗传系统发育树的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落组成，并比较二者的差别，鉴定被13C底物所标记的微生物群落。 2SIP技术在土壤功能微生物鉴定中的应用 目前SIP技术在土壤分子生态学研究领域主要应用在原位鉴定介导有机污染物生物降解和碳氮循环过程的功能微生物方面。有机污染物生物降解研究多集中于单环芳烃、PAHs和PCBs的研究，碳氮循环研究多集中于植物-微生物相互作用对陆地生态系统中碳氮转化、土壤中碳氮周转速率、稻田产甲烷机理及产甲烷菌的研究。 2.1SIP技术在土壤有机污染物生物降解研究中应用 在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，SIP技术可以帮助了解在复杂原位土壤环境中，参与各个降解过程和途径中功能微生物种类。Hanson等首次使用PLFA-SIP技术研究甲苯的生物降解，总共提取发现的59种PLFAs中有16种出现13C标记[17]。Christopher等在对农田土壤中苯酚降解菌的研究中，对13C标记苯酚的DNA进行18S-28S内转录间隔区的PCR扩增，T-RFLP分析，成功分离出一种白色细状的真菌，并证实该真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技术对13C标记苯酚的RNA反转录PCR和T-RFLP分析，新发现了3种苯酚降解菌。罗春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技术研究了甲苯、苯和间二甲苯的降解菌，对分离出的13C-DNA进行T-RFLP分析、克隆文库的构建，获得了相应的降解菌，并首次报道了TM7门对甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技术鉴定甲苯退化细菌，鉴定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地区的田间试验中，向受试的粉砂壤土供应13C标记的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通过GC/MS监控土壤中释放的13CO2浓度，以此估测底物降解速率，并将分离得到13C-DNA用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，最终得到29个完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技术，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6种多环芳烃功能的微生物群落，将13C作为标记元素，构建13C-DNA的16SrRNA克隆文库和RT-PCR分析，结果表明不可培养菌PG2不仅可以降解芘，还能降解荧蒽和苯并[A]蒽，从而说明PG2菌对四环PAHs有着良好的降解效果[6]。Tillmann等设计了一个PLFA-SIP微宇宙实验，将PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯联苯中，采用GC-C-IRMS测定不同PLFA13C的丰度，结果表明非优势菌在PCBs好氧降解过程中的主导作用[25]。Shahid等在对五氯酚降解菌的研究中，比较了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技术的鉴定效果，结果表明RNA-SIP技术可以更好反映功能微生物群落的变化趋势[11]。Sul等将DNA-SIP和宏基因组技术结合，对13C-联苯-DNA中芳烃双加氧酶基因片段PCR扩增，得到两串与bphA相似的序列组，构建1568粘粒克隆文库，发现除含bphAE基因外，还含有属于γ-变形菌纲的未知基因片段，该片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平转移而形成的[26]。 2.2SIP技术在土壤C循环中的应用 土壤C转化是微生物主导的生物地球化学过程，SIP技术能够很好地将微生物群落与其功能联系起来，加深人们对陆地生态系统重要C循环过程的认识。Boschker等最先使用PLFA-SIP技术进行甲烷营养菌的研究[7]，随后，DNA-SIP技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活种群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4对取自罗马尼亚MovileCave地下水系统的样品进行短期培养，以DNA-SIP技术为前提确定了3类含有编码甲烷单氧化酶基因的甲烷营养菌，并通过与非甲烷营养菌比对证明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究养分添加对甲烷营养菌多样性的影响时，人工添加养分在一定程度上可避免交叉取食，改进了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松树林土壤中的甲烷营养菌群落结构组成与CH4氧化率的联系，并简短讨论了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，并将卤化甲烷的全球循环同一组目前已知的卤化甲烷营养菌特征群联系了起来[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技术进行甲醇营养菌的研究，通过13CH3OH培养森林土壤，证明被13C标记的细菌16SrRNA基因序列与已知可培养的甲醇营养菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技术证明了稻田土壤中，甲酸盐中的C首先被光营养的初级和次级生产者利用，随后产生的有机物被其他微生物利用[31]。陆雅海等用13CO2对水稻进行脉冲标记培养，利用RNA-SIP技术与T-RFLP分析，获得水稻根际的产甲烷菌，并通过厌氧和好氧条件的对比，表明根际环境和降解过程的多相性[32，13]。该团队还利用PLFA-SIP描述了水稻根际微生物活性的空间变化，提出在根际革兰氏阴性菌和真核微生物在同化根派生碳过程中最活跃，同时描述了围绕根际的活性群落的空间系统变化[9]。 2.3SIP技术在土壤N循环中的应用 15N作为生物体内大分子合成的组成元素，可结合SIP技术研究土壤中氮循环过程的各类微生物功能群及其相互作用。Georg等利用标记和未标记的N进行纯微生物培养，结果显示15N-DNA-SIP技术是可行的，但存在一定局限性，如可视条带需要大量的DNA，15N-DNA的理想丰度要求大于50%等[33]。Buckley等通过改变基因G+C含量来增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分离强度，为原位追踪利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鉴定了独立生存的固氮微生物，通过分析15N标记DNA的16SrRNA，发现了3组新固氮微生物[34-35]。贾仲君等采用SIP技术示踪农田土壤氨氧化微生物DNA，发现相对于古菌，细菌是土壤硝化过程的主要驱动者[36]。贺纪正等对农田土壤生态系统中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）进行一系列研究，得出二者在根际土壤中的丰度、组成对环境的响应占主导作用[37]，并发现土壤中硝化作用伴随着古菌amoA的基因丰度和多样性变化，进一步证明了氨氧化古菌可同化CO2，属于自养型微生物[38]。Jennifer等结合RNA-SIP和DNA-SIP技术，再次证明AOA可通过两种途径固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到验证，进而强调了AOA在硝化和CO2固定过程中的重要性[39]。Karen等以北美黄松林为研究对象，应用H218O-SIP技术调查土壤中氨氧化微生物的生长与死亡情况，发现人工添加氨可刺激AOB的生长，与此同时AOA的死亡数量增加，而AOB则不受影响[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消减过程时，用13C标记的琥珀酸盐作为电子供体，鉴定了同化琥珀酸盐的微生物，指出大多数N2O消减微生物属于草螺菌属和固氮螺菌属。并证明前者消减速度大于后者，在水稻土N2O的减少过程中发挥重要作用[41]。#p#分页标题#e# 3研究展望 SIP技术能有效降低环境微生物群落分析的复杂度，获得功能微生物的目的基因，已成为原位分离功能微生物的重要手段。随着新一代454高通量测序技术的发展，SIP技术可最大程度地认识不可培养微生物的遗传组成和生命活动，获取其功能基因，优化并人工合成在原位环境中具有高效同化或降解作用的新基因。结合土壤化学等方面知识，共同探讨土壤环境中功能微生物的代谢途径和同化过程，挖掘微生物基因资源，鉴别土壤关键元素循环的微生物驱动机制等，将是未来研究发展的热点和重点。
近代化学分析领域中，如何同时做到多元素的快速分析一直是一个待突破的技术重点和难点，通过各国科研人员的不断探索和试验研究，发现应用原子发射和原子吸收等方法对于多元素的快速分析的效果是十分明显的。但是这些分析方法的在具体的应用中还存在一定的弊端，主要表现为试验中的试液制备的时间较长、试样分解过程较慢，尤其是对于一些难溶试样进行的分解，不仅会使操作更加复杂，还会耗费更长的试验时间，这种应用中的缺点，严重制约着原子发射和原子吸收法的试验效率，使得该类分析方法并不适合大量的推广和应用。所以，急需一种更加有效和高速的加热方法来取代现有的加热方式，以便可以更加快速的分解实验试剂。
为了突破这种传统加热方式的局限性，国际上的一些国家的科研人员，已经在研究和应用一种新型的微波炉加热快速分解试样的新技术，并取得了一定的研究成果。在最初的研发阶段，该种加热技术主要应用于敞口系统中，而随着该技术的不断发展，目前已经实现了微波能加热与热压分解技术的结合。微波能加热的最主要的优点是受热物内外瞬间一起加热，速度快且热损耗小，热能利用率高。近些年我国的化学分析专业人士对于该技术也进行了一定的研究，先是何华生及钱鸿森对微波能加热及其在国民经济发展中的应用作过相关的介绍，而后李明等首次在国内应用微波分解矿样，另外，张玉祥在论述近代分析化学的新进展中，也把微波能技术推荐为重要的新进展之一。同时还有，吴瑞林在对难溶试样热压分解法的论述中，指出微波加热是改进热压分解法的一种重要途径。所以，基于以上这些学者的研究和论述，笔者将在本文中重点对微波能分解岩石、矿物在化学分析中的应用进行阐述。
一、微波能加热原理
微波加热系统的主要工作原理是：用直流电源可提供微波发生器的磁控管所需的直流功率。通电的情况下，磁控管会产生一定的微波功率，然后将通过波导输送到微波加热器中，在微波场的作用下使被加热物体的内外部同时受到加热。我们已经知道在外加电场的作用下，可大大影响分子内部的结构，因而也影响分子和原子们的性质。另外，在加热的过程中除了极性分子外，非极性分子受到外界电场的作用，也会因此而极化而暂时变成极性分子。
在微波能作用下加热的简要原理：在电容器的两极板之间放一杯水，电容器与转换开关以及电池相连接。当开关合上时两极板间产生的电场作用，使杯中的水分子带正电的氢端趋向电容器的负极，并使带负电的氧端趋向正极，这就使水分子按电场方向规则地排列。如转换开关打向相反方向，则电容器极板产生的电场方向与前相反，水分子的排列也跟着转向。如不断地快速转换开关方向，则外加电场方向也迅速变换，导致水分子的方向也不断变化而摆动并受相邻分子的阻碍，产生相似于摩擦的作用，使部分能量转化为分子杂乱运动的能量，加剧了分子运动，使水温迅速升高。外加电场频率越高，极性分子摆动越快，产生的热量就越多，外加电场越强，分子摆动振幅也越大，产生的热量也越大。
由此可见，微波能加热的工作原理是通过影响物质中的原子或者分子的带点方向实现的，并且通过不同方向的快速转换，形成高频率和高强度的电场，从而产生热量。
二、微波能分解试样的反应原理
在化学分析中，为了分解试样必须同时进行化学反应，而为了促进化学反应的形成就必须要加入化学溶剂。与常见的传统加热反应的方法不同，微波加热同时发生在试样内部与外部。由于待分解试样的微粒和溶剂（如混合酸等)的良好接触是快速溶解的关键，那么产生在微粒上的局部内热量促使微粒破裂，暴露出新鲜的表面，有利于化学反应，所以微波加热是一种更加快速和有效的加热分解的方式。另外，被加热的介电液体(酸或者水)和介电微粒反应，形成高于微粒表面的热量，产生较大温差，从而形成了强烈的热传递流，并搅动着粒子表面的薄层及溶液，使新鲜表面不断暴露于新鲜的溶液中，从而大大加速与强化了分解过程，达到快速分解试样的目的。如分解反应不是在敞口容器中，而是在封闭的高压弹中进行时，溶剂，例如王水中分解所产生的氯、氧化氮等不会逸出容器而损失，在高温产生的高压下，它们在溶液中的浓度较高，且由于高温及微波能的作用，加速氯分子分解为氯原子，起到活化作用，进一步加速了试样的分解反应。
所以，从分解试样的角度来看，微波能加热是一种内外同时进行的分解，相较于传统的由外至内的加热方式，能够起到更好的促进作用，不仅可以均匀导热，还能够加速分解效率。
三、微波能加热过程中的问题与特点
微波能加热虽然有着先进的技术优势，但是就其实际应用来看，并不是十分完善的，同其他的加热技术一样，也存在着一些问题，下文中，笔者将主要对微波能加热过程中易出现的各种问题和其应用特点进行阐述。
在化学分析试样的分解中，国外使用的微波加热炉通常都是市售微波炉，因而价廉，购买方便。而供分析应用的微波炉如美国麦克仪器公司和美国国家标准局联合研制的MDS-siD型微波热压装置，以及中国9759工厂研制的微波高压溶样器，这两种装置都已在国内出售。但使用时应该注意的是，对没有应用密闭热压器的微波炉，须避免酸雾的腐蚀，因为一旦出现微波辐射的泄漏，会严重的伤害操作人员。炉内腔材料的特性应具有防止酸的侵蚀、能承受快速加热和冷却的能力，所以可选用硼硅酸盐玻璃箱、酸雾气体洗涤器及玻璃干燥器作为设备配置。还应注意微波炉存在过热点所产生的不平衡加热，避免在空的或类似于空的情况下操作，不然会损伤磁控管，有时可把盛水的烧杯放入炉内，来平衡其炉内的温度。
另外，实践中我们总结出的应用过程中微波能加热的主要特点主要有以下几个:
（1）场强高温
所谓的场强高温的特点，就是指在使用微波能加热的过程中，因为受到电磁的影响，会在一定的作业范围内形成较强大的磁场，所以要注意对实验周围的环境进行事先处理。另外，加热的过程中会产生很高的热量，所以操作员要注意做好相关的防护措施，以免在试验过程中被意外灼伤。
（2）高频高温
这一特点指的是在微波能加热的过程中，会产生较大频率的炉内高温震荡，因为微波加热是一种对物质内部和外部同时进行的加热，所以其具有高频高温的特点。
（3）穿透力强
同样的原理，因为微波能加热是一种利用物质中的分子和原子的电荷方向的不断调转而形成的加热方式，其对于待加热的物质来说，具有很强的穿透效果，可以直接作用于岩石矿物质的内部，对其进行加热，所以这种穿透性是同它的作用原理密不可分的，传统的方法之所以没有这样的穿透力，就是受限于由外至内的加热方式。
（4）热惯性小
所谓的热惯性，指的是物质在加热前会有一个比较缓慢的反应和适应阶段，而加热后对于热量的消解也需要很长的时间。微波能是一种在电磁作用的基础上形成的能量，所以其在使用的过程中具有比其他加热方法更小的热惯性，这种性质同时也使其获得了更加灵活的操作性，并且能够在操作的过程中实现能量和能源的节约。
（5）选择性加热
即有针对性的加热，该特点与上文中阐述的内外部同时加热的特点并不相矛盾，因为微波能加热更加便于我们的灵活操作，我们可以有针对性的对目标加热地区进行电磁作用，而被选定的范围内会产生内外部同时加热的现象。
（6）改善劳动环境和劳动条件
通过对微波能加热原理的分析，我们发现其无论是使用的设备还是操作的程序，都更加的简单方便，有利于改善实验室内的工作环境，给技术人员提供一个相对安全洁净的工作场所。另外，由于操作程序简单，可以在相同的工作任务的前提下降低技术人员的工作强度和工作量，从而改善了技术员的劳动条件。
四、在岩石、矿物分析中的应用
上文中对于微波能技术的这些原理和特点的分析，都是为了使其能够更好的应用于岩石矿物的解析中，试验中具体的操作如下：
1、称取粉末试样200毫克置于聚四氟乙烯或聚碳酸醋杯里，加5毫升王水和2毫升氢氟酸，加盖后置于硼硅玻璃真空干燥器里。
2、放上一个盛50毫升水的小烧杯，进行部分抽空，然后放在微波炉里加热3分钟，取出干燥器放在通风柜里排除酸雾。
3、在分解试样的杯中加1克硼酸，加热10分钟，滤去残渣，滤液稀释到100毫升，用ICP-AES法测定试样中的铝、砷、钡等二十多个元素。
实践中此方已用于分析岩石、矿物(如辉绿岩及玄武岩等)、油页岩及沉积物，并且应用结果表明该方法具有良好的重现性和准确度。
整个试验过程中我们可以看到，微波能加热分解的方法的操作步骤简单，仅需三步即可完成，这样不仅便于技术人员学习和操作，还大大的提高了分解的效率。另外值得注意的是，微波加热分解试样的过程中，最重要的是防止样品过热或蒸干，否则将会引起硅呈气态的四氟化硅而损失，还可能会损失一些其它挥发性元素，将会降低分解后的式样的浓度和纯度。过去，传统的分析方法要做到岩石、矿物在酸中分解需几个小时才能完成，而用微波分解只用几分钟，这种分解时间上的差异是微波能分解优于传统的分析方法的又一个非常重要的特点。
国外的学者研究了矿山、工厂及熔炼厂的试样分析，使用了几种酸溶解方法，其中一种是采用传统的方法在电热板上用敞口烧杯分解，这种方法在一般情况下加热约需一至两个小时，能获得适于原子吸收分光光度法测定所用的试液；
而另一种方法是采用在高压弹中微波加热分解。将待加热的试样(原料及精矿0.5克，尾矿1克)与1.5克氯酸钾，10毫升浓硝酸及5毫升氢氟酸，一同加入150毫升容积的聚四氟乙烯容器中，用扳手拧紧盖子。一次性放入四个这样配置的容器在炊具式微波炉(Toshi-b二式ER-BOOBTC)中，使其在477W下保持3分钟，然后取出容器再于冰槽中冷却5分钟后打开盖子，此法可在10分钟内制得试液。
同样的，使用上述两种不同方法对试样中的镍和铜进行加热分解，结果表明，两种试验所得的分析值基本相同，但是试验效率的差距却非常大，微波能加热分析法明显的要优于传统的加热方法。
所以，研究人员得出结论:对某些矿泥来说，用通常方法进行干燥的时间约需3或5个小时，而凡能缩短这一过程的任何手段都能节约时间和能耗，所以只要是在保证干燥效果的基础上，作业时间越短的方法就越应该被优先采用。
上述两种实验的结果说明:对大多数的矿泥和湿的含水块状试料，如采用微波干燥法能在十五分钟内成功地完成烘干操作，而传统的加热方法则需几倍的时间才能完成。例如二十克重含有68肠水份的碳酸钡试样，在一百零五摄氏度的电烘箱中烘干至恒重需要三个小时，而微波烘干仅需15分钟。这是因为通常的烘干方法，加热多是由表及里。而微波则是里外一起均匀、快速地加热。
随后，该研究组的人员又对微波加热分解各种试样(无机试样与有机物试样)进行了试验，以制备原子吸收和电感祸合等离子发射光谱分析用的试液。试验中检测了试样粒度对分解时间的影响，及微波加热硝酸的温度一压力曲线，并讨论了使用各种酸来分解无机试样的情况。
五、微波能在化学分析中的应用前景
因为微波能具有的一系列使用中的优势和特点，使得微波能近些年来的发展很快，尤其是在化学分析领域中，微波加热分解岩石、长石、矿物、煤、烟灰、沉积物、油页岩、生物、塑料、合金钢等试样己有一些相关，但总体来看数量不多，而且研究所涉及的研究面还比较小，深度也有待挖掘，尤其是难分解的许多岩石、矿物、氧化物(如氧化铝)、氮化物(如氮化硅)、稀有金属(如错、铅)、贵金属及贵金属合金(如铱、锗、饿、钉等的合金)等的分解，及分解机理还待深入的研究。与此同时，相对于国外而言，我国在微波能加热分解技术方面的试验研究还处于起步阶段，对于微波能的试验中的各种特点的研究还不够深入，不利于微波能的广泛的推广，科研人员应该加强对于其试验特性的研究，以便更好的应用于岩石矿物的分析实际中。由于热压分解技术在解决难溶试样分解方面有其独到的优点，已有大量资料发表，而近年来把微波加热与热压分解的两技术结合使用，已是一项发展中的新技术，它必定将为上述难分解试样的研究与应用作出新的贡献。
在分析化学领域，微波能除用于加热外，还有许多其它方面的研究与应用，如微波化学和微波等离子体可用来促进某些化学反应，常见的如微波等离子体——发射光谱，微波等离子体——质谱，气相色谱——微波等离子体发射光谱，以及利用微波测定稀土溶液的浓度，试验中还发现微波能产生活性氧灰化有机物根据带线传感器的测湿原理的微波法测定原盐含水量，这些都是微波法在分析化学领域的多方面应用的成果，在此基础上，我们要不断的研究和探索，发掘微波法的更多应用优势领域，使我国在这方面的技术能够迅速追赶和超越其他国家，其中，使微波法用于煤中无机硫的测定就是一个很好的新的拓展方向。
总之，我们看到在分析化学领域中的几个方面，微波能的研究都有不同程度的进展，但仍有许多问题尚待拓展与深化，微波光声谱就是其中之一。结合微波在讯、导航、食品、木材、印刷、染料、灭菌、醇化、治癌等方面的发展，微波能应用技术己在科技与工业等领域展现出广阔的前景，也必将为分析化学的发展作出新贡献。
综上所述，本文中笔者从微波能加热原理、微波能分解试样的反应原理、微波能加热过程中的问题与特点、微波能加热在岩石、矿物分析中的应用以及微波能在化学分析中的应用前景等五个方面阐述了微波能分析方法在的应用，并认为微波能是一种较之传统的加热方法更为先进和高效的分析方法，应该被广泛的应用于岩石矿物的分析中，笔者希望以此能够为推动我国的微波能技术的发展尽一些绵薄之力，也希望能够抛砖引玉，引发学界对该技术的相关探讨，诸多不足，还望批评指正。
1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分离培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DN段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
1.1自然生物膜的培养采用以南京玄武湖湖水配置的BG11培养液［17］培养自然生物膜．采用聚氯乙烯材质的弹性立体填料(200mm×0.5mm)作为载体，该材料的添加对水质以及生物膜的生长没有副作用;材料使用前用0.1mol/L的HCl溶液浸泡12h，并使用去离子水反复清洗，以去除杂质．生物膜的培养在盛有30LBG11培养液的透明玻璃容器中进行，容器中添加一定长度的弹性立体填料［18］．培养过程中，在容器口处用空隙尼龙网包扎以防止昆虫以及其他杂物落入．保持水位不变，并定期观察生物膜长势情况．试验期间温度保持在20～38℃之间．
1.2自然生物膜对染料的净化试验试验先进行自然生物膜的扩大培养，即在自然光照的条件下利用BG11培养液于温室下进行静态培养．挂膜2个月左右后，弹性立体填料表面形成致密的深绿色生物膜，生物膜长势成熟，生长旺盛．剪取每段长约20cm且挂有生物膜的弹性材料，置于5L的玻璃容器中，并设立试验组和对照组．其中，试验组中ρ(RhB)为0.5mg/L，对照组不添加RhB，每组设3个重复．试验过程中，每天定时采集水样，用聚醚砜微孔滤膜(孔径0.45μm，滤头直径1.3cm)过滤，采用紫外可见分光光度计(UV2450，岛津公司，日本)测定ρ(RhB)，做好相关记录．采样测试试验共进行11d，当试验组中ρ(RhB)处于较低水平(水质较清澈)后试验结束．
1.3PLFA法测定微生物群落多样性微生物PLFA的提取参照Bligh-Dyer修正方法［19］，以酯化C19∶0为内标，提取、纯化、分析测定流程:取2g干燥生物膜，加20mL氯仿－甲醇－柠檬酸缓冲液(体积比为1∶2∶0.8)直接抽提样品的总脂肪酸，提取的总脂肪酸经硅胶柱(SPE-SI)分离为中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸;其中磷脂酸溶于甲醇－甲苯(体积比为1∶1)溶液，加入10mL0.2mol/LKOH，37℃下酯化15min，用GC-MS(gaschromatograph-massspectrometry，sturn，Varian，美国)分析仪进行不同分子的分离;采用PLFA标准谱图(bacterialfattyacidstandards)和美国商品化的MIDI系统(microbialidentificationsystem)来识别与定量PLFA．
1.4Biolog法测定微生物功能多样性Biolog方法是通过检测样品中微生物对Biolog公司生产的微孔板中的31种不同碳源利用情况来反映微生物群落水平的生理轮廓(communitylevelphysiologicalprofiles，CLPP)，以AWCD(averagewellcolordevelopment，颜色变化率)显示微生物群落对不同碳源代谢的总体情况，其变化速率反映了微生物的代谢活性，最终的AWCD与微生物群落中能利用单一碳源的微生物的数目和种类有关［20］．Biolog法测定微生物功能多样性采用Eco微孔板(BiologHayward，CA，USA)，每块板有96个孔，分为3组，可以同时完成3个重复．每组32个孔，其中第1个孔不含任何碳源，作为对照，其余31个孔各含有1个单独的碳源和四氮唑蓝．具体操作:准确称取相当于5.00g干质量(按含水量换算)的生物膜，置于灭菌的45mL生理盐水(0.85%NaCl)中，室温下180r/min振荡30min后取出，静置5min得到生物膜悬液;在超净工作台中吸取生物膜悬液1mL置于19mL事先灭菌的生理盐水中进行稀释;将稀释后的生物膜悬液接种于Eco微孔板中，每孔150μL，每样1板(为3次重复)，置于25℃暗箱连续培养，分别于24、48、72、96、120、144h在590nm下测定OD值．每个样品的AWCD的计算方法［21］:AWCD=［∑31i=1(Ci－R)］/31式中:Ci为第i个反应孔的OD值;R为对照孔的OD值．另外，主成分分析及碳源利用分析均选用72h的OD值进行计算．
1.5数据统计方法采用MSExcel2007和Origin8.0对数据进行统计和绘图;采用SPSS16.0中的Duncan法和DateReduction程序分别对数据进行差异显著性分析和主成分分析．
2结果与讨论
2.1净化效果由图2可见，自然水体生物膜对RhB染料具有一定的去除效果．随着时间的增加，ρ(RhB)持续降低．在染料添加的第1天，RhB的去除率达到了29.2%，之后几天每d的去除率降至3.9%左右，测试期内总去除率为68.6%．第1天RhB去除率较高的原因可能是吸附在净化过程的开始阶段起到重要作用，吸附过程速率较快［3］．之后几天仍保持一定的RhB去除率可能与生物吸收降解以及光降解有一定关系［22］;但是对照试验证明，该条件下光照对RhB的降解影响较小，总去除率约7.3%，因此，在该试验的采样期间光降解作用可以忽略．WU等［10］对相关的研究报道进行了综述，指出微生物聚集体对污染物质的去除机理主要有吸收、降解和吸附作用．自然生物膜作为一种微生物聚集体，其对RhB的净化机理也可能包含了吸附作用、吸收和降解作用．康春莉等［23］研究证明，自然生物膜中的胞外聚合物的含量占总有机质的80%以上，并且自然生物膜表面存在着大量的阴离子基团(如羧基、羰基等)，这些电负基团对阳离子型污染物质具有静电吸附作用．Solis等［24］综述了近几年真菌、细菌和藻类在染料废水脱色降解中的作用和效果，并指出利用微生物进行染料脱色和降解是经济有效的方法．真菌、细菌和藻类均可以降解部分染料，特别是有些白腐真菌的脱色能力已有了大量的研究结果．Maulin等［25］分离出可以降解偶氮染料的细菌，并发现在pH为6，温度为37℃时该菌对染料的去除率达80%以上．自然生物膜作为一种典型的微生物聚集体，含有大量的真菌、细菌和藻类，其中部分微生物可能对染料具有一定的净化和降解效果;然而环境中的pH、温度、含碳量和含氮量都可能会影响净化效果，从而使得自然生物膜对RhB的去除效果仍处于较低水平．
2.2环境扫描电镜(ESEM)观察采用Quanta200环境扫描电镜对自然生物膜在处理RhB废水前后进行ESEM(environmentalscanningelectronmicroscope，环境扫描电镜)扫描摄像，结果如图3所示．由图3可见，对照组生物膜外表面比较光滑，界限分明，表面大量的丝状物主要为藻类;添加RhB10d后的生物膜边界处较为粗糙，并且呈网状结构，原本界限分明的丝状物出现了增生．究其原因，可能是RhB这种酚类化合物接触了自然生物膜上的微生物，与微生物细胞的蛋白发生化学反应，从而对微生物产生毒性胁迫，诱使其在表面分泌某种物质，进而与RhB结合，或将其隔离于细胞体外来达到自我保护的目的．杨翠云等［26］研究表明，微囊藻毒素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的胁迫作用，细胞通过调节细胞内可溶性蛋白和可溶性糖的含量来抵抗外界胁迫，但随着处理时间的延长，细菌逐渐适应了这种胁迫，恢复正常的生长．李淑英等［27］研究表明，Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+对大薸根际微生物的影响，随微生物区系或生理类群和重金属胁迫浓度的不同而不同，Hg2+对放线菌、细菌、真菌的毒性最强，Pb2+次之．
2.3RhB对自然生物膜微生物群落结构特征的影响PLFA法通过测定微生物膜上的脂肪酸片段结构，分析微生物群落结构和生物量在不同环境中的变化．因为不同类群微生物含有的PLFA种类和数量均不相同，即PLFA和微生物类群数量之间存在着对应的关系，因此该技术常被应用于微生物生态学的研究中，以定量描述土壤、底泥及海水等生境中微生物的群落结构［28-29］．该研究采用PLFA法对微生物生物量以及各菌群进行分析，将试验得到的生物膜微生物磷脂脂肪酸量进行统计分析，可以判断出微生物群落结构多样性．PLFA以“总碳数∶双键数ω双键距离分子末端位置”命名;前缀a和i分别表示支链的反异构和异构，cy表示环丙烷脂肪酸;后缀c表示顺式脂肪酸，t表示反式脂肪酸;10Me表示一个甲基侧链在距分子末端第10个碳原子上．不同PLF段对应的微生物群落如表1［30-31］所示．试验结果见表2。由表2可见，对照组的总PLFA含量大于试验组，说明RhB的添加对生物膜微生物的生物量有一定的影响．RhB的添加使自然生物膜微生物的总PLFA含量减少52.23%，使细菌、真菌和放线菌的数量分别减少了75.81%、67.03%、100%．其中，放线菌几乎消失，这可能是由于放线菌对染料的毒害性更受敏感所致．李淑英等［27］研究发现，微生物对Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+的敏感性表现为放线菌＞细菌＞真菌．但是，自然生物膜中的微生物并未完全被破坏，仍保持一定的数量和种类．为了获得更多可靠信息，不考虑相对含量低于1.0%的单体PLFA，对其余含量较高的PLFA进行主成分分析，提取的前2个主成分的累积贡献率达83.66%，其中PC1(第一主成分)的贡献率为61.06%，PC2(第二主成分)的贡献率为22.60%，分析结果如图4所示．由图4(a)可见，试验组与对照组对于自然生物膜微生物群落PLFA的影响区分较明显，其中，试验组微生物主要表现为与PC2相关的微生物种类，而对照组微生物主要表现为与PC1相关的微生物种类．由图4(b)可见，革兰氏阳性菌的特征脂肪酸(如i15∶0、i17∶0)及放线菌的特征脂肪酸〔如17∶0(10Me)〕在PC1上载荷值较高，说明PC1是它们的代表因子．a16∶0、14∶0是表征革兰氏阳性菌的脂肪酸，在PC2载荷值较高，可以认为PC2是它们的代表因子．综上，RhB对自然生物膜上革兰氏阳性菌和放线菌影响的差异较明显．
2.4微生物群落功能多样性添加RhB不仅影响了自然生物膜上微生物的群落结构和数量，也影响了其活性．由图5(a)可见，在0～24h内，对照组和试验组的微生物群落的AWCD均较低或只有轻微增加;24～48h内2种微生物群落的AWCD随时间表现出几何级数增加;48h至培结束(144h)，2种微生物群落的AWCD随时间的增速趋于缓慢直至达到平衡．无RhB添加的对照组AWCD始终大于试验组，表明接触了RhB的生物膜微生物利用单一碳源的能力减弱了．究其原因，生物膜上的有机质可能与RhB相互作用，降低了其生物有效性［32］．为研究生物膜微生物群落碳源利用多样性的特点，以培养72h的样品为例，对Biolog测试数据进行标准化变换后用于主成分分析，结果见图5(b)．其中，PC1的贡献率为23.59%，PC2的贡献率为18.37%．由图5(b)可见，对照组和试验组表现出了明显的分布差异．Garland等［21］认为，各样本在空间上位置的不同是和碳底物的利用能力相关联的．具体而言，各样本在主成分空间不同轴上的差异是与聚集在该轴上碳源的利用能力相联系的．因此，在RhB的影响下，自然生物膜微生物群落对31种碳源的利用表现出了差异，说明其活性受到了影响．但是这种影响是否对自然生物膜有利尚需进一步判断．另外对与PC1和PC2具有较高相关性的6个碳源进行分析，结果如表3所示．由表3可见，在PC1上载荷较高的6种碳源中，有3种氨基酸、2种碳水化合物、1种多聚物;在PC2上载荷较高的6种碳源中，有3种碳水化合物，羧酸、多聚物和酚酸类各1种，说明影响PC1和PC2的碳源以碳水化合物为主．综上，使自然生物膜微生物群落代谢多样性表现出差异的主要碳源为碳水化合物类，其次为氨基酸类．
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2014.01.552
【中图分类号】R9【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2014）01-0375-01
临床微生物检验全面的质量管理包括：分析前质量管理、分析中质量管理、分析后质量管理。平时我们说质量控制，大多数临床医师甚至实验室工作人员都会认为这是实验室的事，也就是只注重了分析中的质量控制。有学者对发生在不同阶段的误差率进行了统计，发现由于分析前各种因素导致的误差率占总误差率的46.0%-68.2%，由于分析中产生的误差率在占总误差的15%以下，由分析后原因导致的误差率占总误差的18.5%-47.0%。由此可见，分析前因素是目前全面质量管理中最薄弱的环节，分析后的质量管理也不容忽视。因此，加强对分析前、分析后质量管理对微生物检验结果的准确可靠，提高医疗质量是非常重要的。
分析后质量控制是全面质量管理的最后一道程序，随着微生物实验室各项服务的进一步完善和临床需求的不断增多，实验室和临床之间的沟通在分析后质量管理中也越来越重要。如今国内外大多数学者认为分析后质量管理包括临床微生物检验后结果确认、规范报告、授权、传送报告、结果解释与咨询服务、临床微生物室样本的保存等。
1对微生物检验结果分析后的系统性评审
就是检验后要对分析的整个过程进行回顾，以评价检验结果与已知的患者的临床信息的符合程度。这一点目前已引起越来越多微生物实验室的高度重视。包括：①样本采集前患者的准备情况，及《标本采集手册》的执行情况。样本采集是否合格，如血培养采集时间的要求，痰培养、尿培养患者的准备情况等。②至采集样本到微生物实验室接收样本的这段时间里，医护人员对样本的处理是否得当，例如：室温、冷藏、保温、立即送检等。③微生物实验室是否按相关规定接收或拒收临床样本。让步标本、拒收标本应有详细的记录，并在检验报告单上备注栏给予说明，结果解释时也要说明，供临床医师参考。④对微生物检验结果进行全面核对。检查是否存在错报、漏报，是否书写错误。药敏结果的审查，对不常见或患者药敏结果前后不一致（鉴定为同一种菌），应检查是否存在污染，复查平板上菌落的纯度，和以前的药敏比较，必要时重做药敏或鉴定。
2报告填写要规范
检验项目要清楚，检验样本性质要明确，患者信息准确全面，包括：姓名、性别、年龄、科别、床号等；样本的采集时间和日期，接收标本时间，报告日期与时间，医师可据此推算出整个检验的全过程所经历的时间；报告实验室的名称；血培养应注明报阳时间，据此可帮助医师鉴别其为感染菌或污染菌；尿培养要报告菌落计数，如果有3种以上的细菌生长，考虑污染，不必再做鉴定和药敏，报：多种细菌生长。要注意检验结果与检验项目的一致性。如痰培养阴性应报告：培养48小时正常咽喉杂菌生长。如果样本是深部痰，培养却无细菌生长，则报告无细菌生长，不能报正咽；可结合涂片分析，如果培养不长菌，而涂片可见较多细菌，可考虑厌氧菌感染，在备注栏给与说明，提示临床考虑厌氧菌感染。粪便培养长出较纯的肠球菌，在备注栏注明：纯培养。这种情况可能是抗生素用得太多，导致菌群失调。血培养阴性应注明培养时间。菌株的药敏结果至少要参照上一年的标准。备注栏可以注明相关的微生物检验结果的解释。
3危急值报告和分级报告决不可少
临床微生物实验室应建立危急值报告制度和分级报告制度，并按制度执行。血培养、脑脊液培养要进行分级报告，以便让临床医师及时了解检验信息，为患者的治疗争取时间。需要报危急值的微生物检验项目有：血培养报阳、脑脊液培养、脑脊液染色镜检，国家规定要上报的传染病如：羊布鲁菌感染、鼠疫耶尔森等要报告当地疾病预防与控制中心，并完成传染病上报程序。报告方式一般选择电话报告，危急值报告要作好记录，包括：患者信息、被通知人姓名、通知人姓名、报告时间、日期、微生物初步检验结果，并保证通知到管床医师知晓。
4微生物检验结果的解释与咨询服务
随着现代医疗诊治的需要，微生物实验室应对临床医师和患者提供结果解释与咨询服务。对于医师和患者的疑惑，从实验室的角度给医师和患者以合理的解释，指导医师看懂微生物检验报告单。通过和医师、患者的沟通，我们也可以了解更多的临床知识，积累更多的经验，更好的服务于临床。
5作好微生物检验样本的保存工作
菌种的保存要符合生物安全的要求，要选择合适的保存方法，对分离到的临床菌株进行分类保存，一方面以备复查时用，另一方面完善微生物室的菌种库。对于检验后不用的样本，各种培养基及其他感染性材料要放入有专门标记的黄色垃圾袋中，注射器的针头、玻片等利器应放入利器盒内。微生物实验室不得存放垃圾，装满的垃圾及时运走，放在指定的安全的地方。感染性医疗垃圾和非感染性垃圾要分开存放，感染性医疗垃圾必须经高压灭菌处理后方可离开实验室，非感染性垃圾可以不高压，按生活垃圾处理。
目前，随着微生物检验技术的不断进步，各种设备的不断更新，微生物检验已深入临床。临床医师对我们的微生物检验结果也越来越重视，微生物实验室和临床的联系越来越紧密。在有限的抗生素的大环境下，指导临床医师合理使用抗生素，防止耐药菌株的出现，微生物实验室和临床应该紧密合作，加强对分析前后的质量管理，更好的服务于临床。
