中图分类号：G642.41 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）36-0184-02
一、三极管放大电路三种组态的共同点
三极管作为放大器件，其主要作用是用来放大交流信号的，但不管其接成任何一种组态，直流偏置都应该是一样的，即发射极正偏、集电极反偏，这样才能满足组成三极管放大电路的基本偏置条件，如图1所示。
二、三极管放大电路三种组态的判断
三极管放大电路的这三种组态的主要特点就在这个“共”字上，即哪个极作为输入、输出信号的交流信号公共端，图2、图3、图4分别画出了共发射极放大电路、共集电极放大电路、共基极放大电路的交流通路示意图。
在确定了公共端后，还要看输入信号加在三极管的哪个电极，输出信号从哪个电极输出。共发射极放大电路，信号由基极输入，集电极输出；共集电极放大电路，信号从基极输入，发射极输出；共基极放大电路，信号从发射极输入，集电极输出。
三、三极管放大电路三种组态的特点和用途
三极管放大电路三种组态在理论上有何区别呢？这是让学生了解和掌握这三种组态特点的关键。首先把三极管看成一个四端网络，通过微变等效分析法可分析出三极管放大电路三种组态的各自特点，如表1所示。
通过表1我们可以分析出：共发射极组态电压、电流放大倍数高，输入电阻中等，输出电阻高，因此该种组态一般适用于放大电路的中间极；共集电极组态电压放大倍数低，电流放大倍数高，最主要的特征是输入电阻高，输出电阻低，因此该种电路适用于输入、输出级及缓冲级；共基极组态电压放大倍数高，电流放大倍数低，输入电阻低，输出电阻高，频率特性好是它的重要特性，因此常用于高频电路或宽带放大器。
四、三极管放大电路不同组态组合放大电路
在讲完三级管放大电路三种基本组态后，要想进一步扩充学生的知识面，就要介绍一下三极管放大电路不同组态组合放大电路。在现实中，可根据三极管三种组态的不同特点，将其中任意两种组态进行组合，构成三极管放大电路的不同组态组合，以充分发挥各自的特点。
（一）共射―共基组合放大电路
共射―共基组合放大电路的交流通路如图5所示，在这两种组态组合放大电路中，后级的输入电阻是前级的负载，由于后级共基极放大电路输入电阻很小，致使前级共发射极组态的电压增益很小，整个电路的电压增益主要由共基极放大电路提供，由于共基极放大电路的频带宽，所以这种组合电路特别适用于高频工作，常常用于视频放大电路。
（二）共集―共射组合放大电路
共集―共射组合放大电路的交流通路如图6所示，第一级共集电极电路主要特点是输入电阻高，用于提高整个电路的输入电阻，第二级共发射极电路主要用于提高电路的放大倍数。
五、三极管放大电路三种组态及组合的实际案例分析
让学生能够理解三极管放大电路三种组态的不同应用是让学生正确理解好这一问题的关键，而实际案例教学是解决好这一问题的最好方法。在教学中，笔者通过以下实例来帮助学生理解和分析这一问题。
实例1：视频放大及视频输出电路。
一般电视机都有音频、视频输入输出转换板，这里给学生介绍一下视频输入信号输入端子部分电路的例子，视频输入端子是为VCD等视频设备提供视频输入信号的输入端，这个电路一般有两部分，一部分为视频放大部分，另一部分为视频信号放大后与内部电路的缓冲及阻抗匹配部分，这两部分由于功能不同，所以各有特点。视频放大部分因主要完成的是视频放大，且视频信号频率较高，故应采用宽带放大器，因此用共基极放大电路较适宜。而与内部电路连接需考虑阻抗匹配，输出阻抗要低，因此应采用共集电极放大电路。
图7为某品牌电视机的这一视频放大转换电路。课上要对这一电路进行简单分析以加强学生的读图能力和分析问题、解决问题的能力。R1、R2、R3、R4、C1、VT1组成共基极放大电路，外接视频输出设备，输入视频信号从VT1发射极输入，集电极输出，C1为VT1基极交流接地电容；R5、R6、R7、VT2组成共集电极放大电路，视频信号通过C2从VT2基极输入，发射极输出。这两级电路由于功能不同，分别采用了不同的组态形式，保证了视频信号的放大及与内部电路之间的阻抗匹配。通过这一实例使学生理解三极管各种组态在电路中的作用，由于问题是从实际案例出发，因此提高了学生的学习兴趣，增强了学生的学习动力，取得了较好的学习效果。
实例2：超外差收音机高放与混频电路。
这个例子是我们经常使用的超外差式收音机电路的一部分，而且是用一个三极管分别组成共发射极和共基极放大电路以完成高频放大和混频两个功能的电路，实际电路如图8所示。在讲这个实例之前先给学生介绍一些超外差收音机的原理，使学生对这个实例更容易理解。从图8中可分析出，双联可变电容器的一部分CA与磁棒线圈B1的主线圈组成了一个串联谐振电路，利用这个电路的选频特性并通过调节可变电容CA对高频信号进行选频，以选出要收听的电台电磁波信号，这个高频电台信号通过磁棒主副线圈的耦合作用传送到三极管VT1的基极，对于这个电台高频信号，三极管VT1组成的是共发射极放大电路，放大后的电台高频信号从集电极输出。同时三极管VT1与振荡线圈B2及双联可变电容的一部分CB组成共基极振荡电路。这里有两个信号：①高频电台信号f1；②振荡器的振荡信号f2。这两个信号同时在VT1基极输入端进行叠加，利用三极管的非线性产生两个频率：f2-f1和f2+f1，在通过选频网络选出f2-f1，这就是超外差收音机中的465KHZ中频信号，这个中频信号再经过中频放大、检波、功率放大推动扬声器发出声音。这里主要是介绍混频电路，因为这个电路既含有共发射极放大电路又含有共基极振荡电路，是一个三极管分别组成两个组态放大电路的实例，因此分析好这个电路对于学生掌握三极管三种组态的应用具有很大的帮助。
六、结语
三极管放大电路三种组态是模拟电子技术课程中较难学的一部分内容，如何让学生学懂、学好这部分内容是授课教师需要考虑的问题。笔者通过改进教学方法，用案例法进行授课，从而取得了较好的教学效果。
参考文献：
关键词： 代谢组学 中医药现代化 证 疗效评价 中药新药
1 代谢组学与中医药学理论体系的联系
中医药学是有着数千年历史的古老科学,在历代医家不懈的医疗实践中,形成了以整体观念和辨证论治为特点的理论体系。所谓整体观念,是关于人体自身的完整性及人与自然和社会环境统一性的认识,是整体思维方法在中医理论中的体现。中医药学非常重视人体的统一性和完整性,认为人体的每个局部都是整体的一部分,都具有整个生命的全部信息；另一方面注重人体与环境的统一性,认为人的生命活动与自然运动规律相统一。这种观念贯穿于中医学对人体的生理活动和病理变化乃至疾病的诊断、预防和治疗等各个方面的理性认识之中。近年来,中医药现代化研究已经成为学术科研上的焦点问题,学者们力图用现代科学方法论来衡量和改造中医药学,却出现了中医药学在现代科学面前无法证明其科学性的尴尬局面[2]。这都是由于现代医学的方法论与中医药学的方法论之间存在着明显的鸿沟,中医药学研究用的是整体思辨的网状思维模式,它注重把握事物之间的联系,而不是事物本身,因而其知识结构是综合的、整体性的；同时,中医药学善于把人与环境因素综合地加以考虑,其思维呈网状结构。而现代医学研究是还原分析的链式思维模式,它是建立在实验分析基础上的,注重研究事物本身的特性,往往忽略了事物之间的联系,其知识结构是分析性的、局部的。然而,人体本身是一个复杂的整体,人体的复杂性及疾病的联系性,与中医的整体网状思维模式接近现代医学,也正由一元化向多元化转变,由单一性向系统型转变。基因组计划基本完成,标志着生物学研究进入了“后基因时代”,而系统生物学研究是后基因时代的最主要研究任务。基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学都是系统生物学的重要组成部分,基因组学、转录组学和蛋白质组学分别从基因、mRNA、蛋白质层面探寻生命的活动,然而,代谢物是生命活动的最终产物,代谢物的水平可以被看作是基因或环境发生变化时生物体作出的最终的应答,正如Oliver Fiehn所认为的“代谢物是基因型到表现型之间的桥梁”[3],“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什么”[4]。因此,代谢组学是系统生物学研究的终点。总之,代谢组学属于全局系统生物学(Global systems biology)研究方法,与中医药学的整体观念相对应；且代谢组学研究的目标是代谢物,而“代谢物是基因型到表现型之间的桥梁”,其研究更接近表现型,由此,代谢组学用于中医药现代化研究具有不可比拟的优势。
2 代谢组学与“证”的现代研究
【分类号】G633.91
一、新课改背景下提倡合作学习与高中生物有效教学的密切关系
有效教学，顾名思义，就是指教学的有效性，“有效”则是指投入少，产出多。具体来说，就是在教学方面投入的人力、物力、财力少，而教学效果佳。因此，有效教学强调学生在学习方面的自主性和在求知上的热情度，强调对学生学习能力上的培养和学习效率的提高，强调全方面培养和发展学生。学生爱学习，会学习，教学效果自然会较佳。这是对传统意义上的教学方式的极大改革，反对以提高分数为目的的填鸭式教育方式。有效教学对教师的能力和素质提出了新的挑战，这种挑战体现在对教师的教学效果的评价方面，这要求教师不断提高自己的教育教学水平和改革教学方式，更新自己的教学观念，注重提高教学的有效性。
合作学习恰恰是为有效教学提供了一个有效的教学途径。与人沟通、合作的本领是适应现代社会发展的必备能力，是在个人学习和工作生涯中的必备素质之一，合作学习正是以此为培养目标而被提出并发展起来的，是我国从传统的应试教育向素质教育改革中应当极力推荐的教学策略。合作学习将学习小组视为一个学习整体，在评价中将其视为一个评价对象，给予整体评价。在具体的学习中，每个小组成员根据安排给自己的具体学习任务进行学习，这些任务需要与其他学习成员合作才能完成，通过这种方式，学习成员的与人沟通和合作的能力可以得到极大的提高，学生学习的自主性得到增强，求知的热情度得到提高，不仅学生与学生之间的沟通增强，学生与老师之间的沟通也得到极大提高，因而，教学的有效性得以实现。
二、小组合作学习在生物课堂教学中的教学应用案例
以“基因突变”一节的教学设计为例。高中生物学课程标准对本节课的内容所作出的要求是“举例说明基因突变的特点和原因，说出基因突变的意义”。基因突变一节的教学重点有两个，一个是基因突变的概念及特点、一个是基因突变的原因。教材以镰刀型细胞贫血症为例，通过对镰刀型细胞贫血症的成因的分析，引入基因突变，然后详细阐述了基因突变的原因、特点及其重要意义。基因突变的意义是本节课的教学难点所在，主要是这一知识点较为抽象。整个认识过程中学生在思维能力方面或多或少的存在一些困难。
1、教学过程
（一）课前准备：教学内容处理
根据教学目标要求、教学内容的特点以及学生所具备的知识基础，将教学内容分解为五个不同的小模块：第一个模块，生物的变异类型。第二个模块，镰刀型细胞贫血症的形成原因。第三个模块，什么是基因突变？第四个模块，基因突变有哪些特点？第五个模块，基因突变在遗传育种上的应用。
（二）W生分组处理
可以根据需要将全班学生分为5个小组，每个小组8人。在上课前，各个小组自行选取自己的学习任务，要求是每个小组必须选择不同的学习任务。学生通过在课外开展“资料收集--资料交流--重新整合--共同学习”等一系列的活动，由各组小组长自行组织本小组内的成员进行学习。在课堂教学过程的第二个阶段，每个小组推荐一个人组成新的小组――“导师”组，“导师”组中的每个成员将自己所掌握的该模块知识轮流介绍给其他成员，要求是达到每个成员都掌握5个小模块的全部基础知识的目标。
（三）课堂教学
（1）资料收集、知识整合与问题处理
在课堂上，学生通过一定时间的再次合作学习，对前期经过“资料收集--资料交流--重新整合--共同学习”所获得的知识进行复习消化，小组内部成员对学习内容做出进一步的取舍，并一起探讨将学习到的知识传授给其他的小组成员的方法。
（2）互助协作与交流
根据学习内容的多少以及合作学习的进展情况，为了顺利让每一位同学都能够掌握5个模块的基础知识，在课堂上要注意为“导师”组内各个成员的之间相互交流学习留出一定时间。为了避免合作学习流于形式，在这个过程中，教师需要制定一些相关的制度对各个小组成员的合作学习行为进行一定的约束。
（3）知识的反馈与不足之处的补救
学生可以通过两个不同的系列小组的合作学习过程掌握本节课如下5个模块的知识点。知识点1：生物变异的类型：①能够说出可遗传的变异与不可遗传的变异之间的本质区别是什么。②能够举出一些可遗传变异和不可遗传变异的相关例子。知识点2：镰刀型细胞贫血症是如何发生的：①镰刀型的红细胞是由异常的血红蛋白引起。②之所以能够形成异常的蛋白质，是因为mRNA上面的碱基的改变而造成它所指导合成的蛋白质中的氨基酸发生改变而造成的。③以DNA的一条单链为模板转录而来的mRNA上面的碱基发生改变，是因为DNA上面的碱基发生了改变。同时，通过查阅其他相关的资料，学生对镰刀型细胞贫血症的症状也有了一定的了解。知识点3：基因突变的概念：①基因突变使一个基因变成它的等位基因。②基因突变是指碱基对的增添、缺失或改变，结果是造成基因结构的改变。知识点4：基因突变的特点：①基因突变具有普遍性，任何生物都可能发生，在自然状态下发生的叫做自然突变，在人为条件下发生的叫做诱发突变。②基因突变是不定向的。③基因突变的低频率性。④基因突变大多是有害的，只有极少数是有利的，而有害还是有利是相对而言的。⑤基因突变往往发生在DNA复制过程中。知识点5：基因突变在遗传育种上的应用：①能够引起基因突变的各种外界诱因，包括物理的，化学的和生物的因素。②太空椒的培育和高产青霉素菌株的选育等都是基因突变在育种工作中的应用，诱变育种可以大大的提高突变率。
结语
真正的教学，其实并没有任何固定的实施方法，关键是在教学过程中使用的方法一定要切合学生的实际需要。独立自主的学习方式并不是被合作学习完全排除在外的，相反，通过个人的独立思考，让学生学习的主体性得到极大的发挥，最终个人的科学素养在合作学习的推动下得到提高，这才是合作学习所追求的方向。
参考文献
在工程制图教学中渗透着丰富的哲学思维，如用归纳与演绎的方法定义基本形体，用抽象思维的方法认识组合体中基本体投影视图的封闭线框，用形象思维的方法认识组合体的构型设计以达到与美学融合的目的。如果教师有意识地将哲学思维贯穿于教学过程中，可以更好地拓展学生学习的思维模式，加深对理论知识的理解程度。
1基本形体的归纳与演绎
组合体是由若干基本体按一定的相对位置经过叠加（包括相贯）、挖切或两者综合使用的方式组合在一起构成的形体。（图略）所示的支座，由圆筒Ⅰ、底板Ⅱ、支架Ⅲ和肋板Ⅳ等4个基本体组合而成。要对组合体结构有更清楚的认识就必须先了解基本形体的概念，而概念是思维的元素，学生的思维都是借助于概念进行的，在学生的认知结构中概念起着至关重要的作用。因此，明确基本形体的定义是至关重要的。
1．1归纳基本形体的定义从组合体中分解出的基本形体除一般的棱柱、棱锥、圆柱、圆锥、圆球、圆环（图略）之外，还会有底板、支撑板、弯板、筋板和搭子等其他形体。常见的棱柱、棱锥、圆柱、圆锥、圆球、圆环等6种基本形体可将它们归纳为柱、锥、球、环4种，将具有共性的东西进行归纳得到基本形体的定义，依据点动成线、线动成面、面动成体的原理，基本形体可作如下定义：动平面或称母面沿某一特定导线（直线或曲线）连续运动（平移或旋转）而形成的立体，称为基本形体。
1．2基本形体的演绎由柱、锥、球、环等基本形体可演绎出多种多样的柱、锥、球、环。柱体的形体特征可定义为具有两个全等且相互平行的端面，各侧面均为矩形（根据数学中微积分观点，将柱体的光滑侧面均看作是无数个小矩形组成），且均与端面垂直。根据柱体形体特征的定义可将底板、支撑板、筋板、箱体等均作为柱体，当描述某一柱体时，只要画出其端面形状，再说明其厚度，即可用简单的语言，准确地表达该柱体的形状，并用其端面形状命名该柱体。如熟悉的长方体是由四棱柱演绎而来的在基本形体的基本特征上也可以衍生出一些次级特征，如长方体的基本特征为拉伸特征，在此基础上又可以有圆角、倒角等次级特征。
2组合体教学中的抽象思维
从几何学的观点看，任何复杂的立体都可以抽象为组合体，组合体可分解为若干基本体，而基本体的投影视图均为封闭的线框。因此可将组合体中的基本体视图抽象为若干个封闭线框。以图1所示支座为例，其三视图如图4（a）所示。在划分基本体时，可在相交、相切处用双点划线将每个基本体的三视图补画完整，并将它们的三视图分解为封闭的线框。其中圆筒部分抽象出来的封闭线框为Ⅰ所指线框，而底板、支架、肋板部分抽象出来的封闭线框分别为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ所指线框。按照“长对正、高平齐、宽相等”的原则，每个封闭线框所对应的基本体（b）所示。在划分与解构基本体的过程中，抽象思维发挥了重要作用。针对组合体的抽象思维，文献提出了“虚实体”的概念，其中心是：虚实体是假想出来的构造体，用于描述组合体中的孔、洞、槽等空心结构，可通过原基本体减去该构造体得到组合体，（图略），其中VS1、VS2即为虚实体。
3组合体教学中的形象思维
工程制图的核心是“图”，其最大的特征就是形象性。形象思维是运用“形象”来思考问题的一种思维方式，它贯穿于过程的始终，是客观事物的整体映像。表象是事物的形象（如形状、结构、位置等）。形象思维过程就是表象运动、加工的过程，这个过程具有形象性、整体性、概括性、跳跃性、情绪性和方向的不确定性等特点。形象思维在组合体中的应用是不言而喻的，特别是在组合体的构型设计中发挥了重要作用。在组合体构型设计中，当给出某一个视图要构型出组合体的形状时，可运用形象思维先将该视图分解为基本体，然后想象出这些基本体的基本特征，依据组合体的构型原则（以几何体构形为主，具有多样、变异、新颖和独特的特点，体现稳定、平衡、动、静等艺术规则）想象出组合体的形状。当用视图和轴测图表达构型设计的各种组合形体时，必须遵循“比例与尺度，均衡与稳定，统一与变化”的美学法则，而人的一般形象思维都以“美”作为准绳。图6（a）所示的阀盖，其对称均衡的结构使形体具有平衡、稳定的效果。（b）所示的形体为非对称的组合体，采用适当的形体分布获得了力学与视觉上的平衡感与稳定感。图6（c）所示的火箭构形，线条流畅且富有美感，显得静中有动，有一触即发的感觉。
4组合体教学中的逻辑思维
[通信作者] *李劲平，副教授，硕士生导师，主要从事中药防治老年病研究，Tel：（0731）82650340，E-mail：
[摘要] 该文提出了多维组学新概念，指出多维组学是研究中药复方药效物质基础与机制研究的恰当方法。以壮骨止痛胶囊抗实验性绝经后骨质疏松作用为例，从中药化学组学、基因转录组学、蛋白质组学等三维组学角度，较系统地阐明了壮骨止痛胶囊防治绝经后骨质疏松的药效物质与作用机制，同时，创造性地设计了一个三维表格直观地展现三维组学研究结果。该研究为中药复方药效物质和作用机制研究提供了一种新的思考方式和解决方案。
[关键词] 多维组学；中药复方；物质基础；机制研究；壮骨止痛胶囊
自然科学发展到20世纪末，随着人类基因组计划（HGP）的实施和完成，一种宏观的、系统的研究思维和研究方法涌现出来了，这就是各类组学（omics）技术。它们包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢物组学、细胞因子组学等，同时在中药化学与药效学研究中出现了中药化学组学新概念。各类组学技术的出现，对于加速疾病的病理机制和药物作用机制研究进程起了巨大推动作用。
中药的药效物质和作用机制研究是中药现代化的重要研究内容，但是，由于中药固有的多成分、多靶点、多效应、多环节作用特点，使得中药药效物质和作用机制研究面临非常大的挑战。现在大多数学者从中药的某一成分或某一作用的角度进行研究，虽然也取得了一些成果，但离真正阐明中药药效物质和作用机制相距甚远。为探索一种新型的、适用于复方中药药效物质和作用机制研究的新思路，本课题组以多维组学（multidimensional omics）探讨壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松症的药效物质和作用机制，取得了预期的研究成果。
1 多维组学的概念
多维组学（multidimensional omics）是指综合应用多种组学方法，通过分析各类组学研究结果之间的内在关系，从多个维度阐明疾病或药物的作用机制。单个组学是一种小系统思维，而多维组学是一种大系统思维，多维组学比单个组学更适合于中药药效物质和作用机制研究。可用于中药作用机制研究的多维组学包括中药化学组学、基因转录组学、蛋白质组学和代谢物组学等。
2 中药复方研究的基本科学问题
多成分、多途径、多靶点、多效性是中药复方的作用特点，中药复方药理研究必需揭开2个黑箱才能真正阐明了中药的药理作用机制。
第1个黑箱是中药复方的药效成分是什么？长期以来，进行中药复方药理研究时对这方面的研究报道非常少，而大量的文献报道集中在中药复方化学成分研究，而和复方药理几乎没有联系。没有阐明药效物质的中药药理不能成为完整意义上的药理研究。上述现象的出现可能与认识上的误区有关，重视中药对机体的病理生理过程的调节，而轻视产生这种调节作用的物质基础研究，同时也可能与研究者的知识背景有关系。目前存在2种解决方法：①先从中药中分离化学单体，再通过药效实验确认其药效，这种方法在前期分离化学单体方面存在非常大的盲目性；②从化学生物学出发，先筛选复方的有效部位群，然后用高效活性筛选方法筛到一些潜在药效成分，再通过药效实验确认其药效，这种方法的盲目性大大降低，针对性大大提高。通过学者们的努力，目前已初步建立了一些“中药化学组学”研究方法如活性导向分离方法[1]、高通量筛选方法[2]、血清药化学法[3]、肠内菌代谢法[4]、肠吸收法[5]、生物色谱法[6-7]、代谢物组学法[8]等。
第2个黑箱是中药复方中含有众多的效应成分，那么，这些效应成分如何调节相关疾病的病理生理过程发挥疗效？中药复方药效成分的多成分是中药复方多途径、多靶点、多效性药理作用特点的物质基础。中药复方多成分、多途径、多靶点、多效性正好对应疾病的多环节、多靶点病理生理特点发挥作用。中药复方的这种作用特点正是中药复方治疗许多复杂疾病获得良效的奥妙所在，但同时也使研究其药理作用机制时遇到很大困难，面对众多的药理指标不知从何处着手研究。因此，必需寻找一种与中药复方作用特点相适应的研究方法，该类研究方法必需具有前瞻性和高通量等特点。基因转录组学、蛋白质组学和代谢物组学等组学则从系统的角度同时对大量基因、蛋白及代谢物进行检测，属于一种系统的解决方法，疾病或药效的任何变化都会在基因组、蛋白质组和代谢物组3个层面表现出来，这几种组学技术同时具有前瞻性和高通量性质，非常适合用于中药复方药理作用机制研究。
综上所述，中药复方作用机制研究应包含两方面的研究，即中药复方的药效物质研究和中药复方药理作用机制研究。由于中药复方的复杂非线性作用特点，采用常规的一维研究方法在研究中遇到很大困难，而采用非线性的“多维组学”研究方法则相对容易。
3 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松作用的三维组学分析
3.1 壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松症的药效学基础 本课题组在古方补骨脂丸基础上结合多年临床用药经验研制成壮骨止痛胶囊，全方由补骨脂、淫羊藿、枸杞、骨碎补、牛膝等7味药物组成，功能补益肝肾、壮骨止痛。经过长期的临床应用证实其治疗绝经后骨质疏松症有良好的临床疗效，并已获得国家新药证书（国药证字[Z20050125]）。经过一系列动物实验和临床实验表明，壮骨止痛胶囊能显著提高去卵巢模型大鼠的骨密度，逆转骨代谢的高转换状态[9]，调节钙磷相关激素和细胞因子[10-11]，改善骨的生物力学性能[12]，延缓骨质疏松症的病理形态学改变[9，13]，对治疗骨质疏松症有良好的疗效。虽然药效学实验充分阐明了壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松症的药效作用，但不清楚壮骨止痛胶囊治疗骨质疏松症的深层次药理作用机制和药效物质基础。
3.2 壮骨止痛胶囊药效物质基础分析 从壮骨止痛胶囊的干浸膏开始，分别用极性由小到大的溶剂石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、水依次进行提取，然后利用去卵巢骨质疏松模型大鼠筛选有效部位，结果表明其石油醚部位和无水乙醇部位为壮骨止痛胶囊的有效部位。然后，通过在体清醒大鼠肠襻吸收实验对无水乙醇部位进行活性成分筛选，通过HPLC比较给药后1，2，3 h不同时点胃肠道中的剩余药量，在HPLC图谱中产生差异的色谱峰即为潜在药效物质峰。再通过萃取、柱色谱分离等技术分离差异峰物质，经药效学筛选后将有效成分经过UV，IR，NMR，MS等鉴定结构。结果从无水乙醇部位分离得到淫羊藿苷、杯苋甾酮、柚皮苷、朝藿定B等有效成分[14-15]。由于石油醚部位物质的极性太小，很难得到分离度满意的HPLC图谱，因此，石油醚部位采用传统的分离方法进行了艰巨的分离工作，经药效学筛选后，最后得到补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定和齐墩果酸等有效成分[16]。至此，基本研究清楚了壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松的中药化学组学基础。
3.3 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的转录基因组学分析 在基本研究清楚了壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的化学组学基础上，接着研究了全方、有效部位和部分有效成分抗绝经后骨质疏松的基因转录组学。结果表明，绝经后骨质疏松大鼠股骨有532个基因表达发生了变化，全方对于骨质疏松模型大鼠股骨的126个表达发生改变的基因均有不同程度的调节作用，这些基因中已知功能的有45个基因，其余81个基因的功能尚不清楚[17]。将这45个基因根据其功能分为细胞保护基因、能量代谢基因、无机离子代谢基因、信号传导基因、细胞结构基因、基因表达相关基因、免疫相关基因、脂代谢基因、细胞损伤修复基因、胞外基质代谢基因等10个功能类群（表1）。与无水乙醇部位比较，石油醚部位主要侧重于对能量代谢基因具有调节作用。与石油醚部位相比，无水乙醇部位主要侧重调节控制基因表达的基因、信号传导基因及胞外基质代谢基因。淫羊藿苷主要对细胞保护基因和能量代谢基因具有调节作用[18-19]。从转录基因组学分析表明随着化学组学的变化，转录组学随之发生相应的变化，并且，壮骨止痛胶囊各化学组对基因转录组的调节各有侧重。
3.4 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的蛋白质组学分析 在研究转录基因组学的同时，课题组研究了壮骨止痛胶囊全方、有效部位和部分有效成分抗绝经后骨质疏松作用的蛋白质组学。结果表明，全方对于骨质疏松模型大鼠股骨的32个蛋白具有调节作用，通过质谱鉴定了其中的21个蛋白[20-21]。这些蛋白分别涉及骨细胞的细胞保护、能量代谢、细胞信号传导、免疫、无机离子代谢、细胞损伤修复、细胞凋亡、细胞迁移等8个方面功能。与无水乙醇部位相比，石油醚部位侧重于对能量代谢相关蛋白的调节。与石油醚部位比较，无水乙醇部位侧重于对细胞信号传导、细胞凋亡、细胞迁移等相关蛋白的调节。淫羊藿苷调节的蛋白涉及细胞保护、能量代谢、信号传导、细胞凋亡、细胞迁移等方面。蛋白质组学分析结果表明随着化学组学的变化，蛋白质组学也随之发生相应的变化，并且，壮骨止痛胶囊各化学组对蛋白质组学的调节各有侧重。
3.5 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的三维组学综合分析 怎样在同一张表格中表现三维及三维以上的组学结果是一个值得探讨的问题，合理的表格设计可以直观地反映各组学研究结果之间的相互关系。本文设计了一种三维表格（表1），各维组学结果集中展现在表格的中间区，中药化学组学作为自变量安排在表格的横列，其他组学作为因变量安排在纵列，在每一个自变量下按一定顺序安排相应因变量，这样便于比较各组学随化学组学而变化的情况。
通过对三维表的分析，发现如下特点：①壮骨止痛胶囊各化学组除了调节共同的基因和蛋白外，每个化学组对基因组和蛋白质组的调节均各有侧重。如石油醚部位侧重对能量代谢基因和蛋白的调节，无水乙醇部位侧重对信胞信号传导相关基因和蛋白的调节，淫羊藿苷侧重于对能量代谢相关基因和蛋白的调节。②转录基因组学研究结果与蛋白质组学研究结果在功能上具有显著相关，但是，除少数基因与蛋白一一对应外，绝大多数基因和蛋白并非存在一一对应的关系。由于基因组学和蛋白质组学2种组学的灵敏度不一致，以及从基因表达到蛋白翻译过程的影响因素太复杂，因此，出现基因组学结果不能与蛋白质组学结果一一对应的现象。另外，基因组学中有大量基因表达已发生变化，但其变化值尚未超过分析规定的阈值。但是，从功能区划来说，2种组学的研究结果是一致的，这也说明很有必要从多维组学角度进行中药物质基础和作用机制研究。③蛋白质组学显示了一些基因组学没有显示的功能变化，如与细胞迁移相关的Myosin light chain 3蛋白在基因组学中没有反映出变化，而细胞迁移与破骨细胞的溶骨活动和成骨细胞的成骨活动密切相关，这也更进一步表明从多维组学研究中药复方药理作用机制的必要性。
从壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松作用的三维组学研究分析可见，对于中药复方的作用机制研究，不能仅仅从单一的复方和单一的组学进行研究，而应从复方、有效部位、有效成分等多层次化学组学，以及基因转录组学、蛋白质组学、代谢物组学等多层次生物组学出发进行研究，才能阐明化学组学与多个生物组学之间的内在变化规律。
[参考文献]
[1] Sezik E， Aslan M， Yesilada E， et al. Hypoglycemic activity of Gentiana olivieri and isolation of the active constituent through bioassay-directed fractionation techniques[J]. Life Sci， 2005，76：1223.
[2] 高虹，欧阳克清，郑旭煦，等.毒蕈胆碱M1受体激动剂的高通量筛选模型[J].中国药理学通报，2003，19（7）：776.
[3] Kamei J， Saitoh A， Asano T， et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of the antitussive principle of Glycyrrhizae Radix （licorice）， a main component of the Kampo preparation Bakumondo-to （ Mai Men-dong-tang ） [J]. J Pharmacol， 2005，507：163.
[4] Zuo F， Zhou Z M， Yan M Z， et al. Metabolism of constituents in Huangqin-Tang， a prescription in traditional Chinese medicine， by human intestinal flora[J]. Biol Pharm Bull， 2002， 25（5）： 558.
[5] Kuo S M. Transepithelial transport and accumulation of flavone in human intestinal Caco-2 cells[J]. Life Sci， 1998， 63（26）：2323.
[6] Mao X Q， Kong L， Luo Q Z， et al. Screening and analysis of permeable compounds in Radix Angelica Sinensis with immobilized liposome chromatography[J]. J Chromatogr B， 2002， 779（2）：331.
[7] 盛亮洪，李睿岩，李萍，等.固定化脂质体色谱研究中药复方的细胞膜通透性成分及其质量控制[J].分析化学，2004，32（12）：1595.
[8] 黄玉荣，魏广力，刘昌孝，等.钩藤多动合剂的药效作用及用代谢组学方法研究其生化机制[J].中草药，2005，36（3）：398.
[9] 莫新民，曾英，彭琼辉，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌性骨质疏松症疗效的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2007，13（3）：195.
[10] 莫新民，曾英，金红，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌性骨质疏松大鼠相关激素与细胞因子影响的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2008，14（8）：634.
[11] 曾英，莫新民，彭琼辉，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌性骨质疏松症无机元素的影响[J].中国中医基础医学杂志，2008，14（7）：500.
[12] 曾英，莫新民，雷晓明，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌性骨质疏松症骨强度和生物力学的影响[J].中国中医基础医学杂志，2007，13（4）：292.
[13] 曾英，莫新民，雷晓明，等.壮骨止痛胶囊对去卵巢雌性骨质疏松症骨密度及相关生化指标的影响[J].湖南中医药大学学报，2008，28（2）：10.
[14] 栗会敏，李劲平，林清，等.壮骨止痛胶囊有效部位在大鼠体内肠襻吸收状态的研究[J].现代医药卫生，2012，28（6）：683.
[15] 李劲平，王小静，曾英，等. 补骨脂定抗实验性绝经后骨质疏松的效应及作用机制研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（11）：1816.
[16] 李劲平，林清，王小静，等. 壮骨止痛胶囊A部分抗骨质疏松有效成分研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1049.
[17] 高峰，莫新民，李劲平，等.去势大鼠骨质疏松症基因表达谱特征初步分析[J].中国中医药信息杂志，2012，19（12）：29.
[18] 高峰，莫新民，李劲平.淫羊藿苷治疗去势大鼠骨质疏松症基因表达谱分析[J].中国中医药信息杂志，2013，20（2）：43.
[中图分类号] R541.61 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0007-03
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因及基因表达发生了可遗传的变化。这些改变包括DNA的甲基化、多种形式的组蛋白修饰及小分子RNA（microRNA）等。个体间疾病易感性及治疗反应性的差异在很大程度上取决于遗传因素[1]。然而，根据全基因组研究，笔者不得不承认遗传表型的改变不仅仅是核苷酸序列的变化[2-3]。表观遗传学与核苷酸的改变共同调控了基因的表达，因而从另一种角度解释了个体间的差异。
表观遗传学研究发现，基因及其表达的遗传性改变不仅仅是指基因突变或基因多样性等DNA序列的变化。已知的三种可调节基因表达的表观遗传学改变主要是：基因组DNA的甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA的调节（如microRNA）。上述机制均涉及外在因素在蛋白质编码序列不变的情况下仍可调节基因转录[4]。表观遗传学调节机制存在个体及组织差异性，并且可以随年龄增长、环境及疾病状态的改变而变化。表观基因组在基因组表达过程中起关键作用，个体间基因表达的不同造成药物不同的反应性，这可能是通过表观遗传学改变进行调节的。因此，目前认为表观遗传学改变可以帮助解释基因突变在药物反应中的作用，继而在临床医学中发挥作用，这一迅速崛起的新学科称为表观遗传药理学。个体间药物的反应性不同，该学科不仅研究表观遗传因子在这一过程中的作用，而且旨在开发新的药物靶点[5]。笔者认为表观遗传药理学与遗传药理学将共同在药理学、临床医学中发挥重要作用。
目前为止，表观遗传药理学的大多数研究集中于肿瘤学领域，例如，研究细胞色素p450在个体间表达的差异。幸运的是，表观遗传学修饰的作用已被应用于解释其他复杂并且多源的现象，应用的范围越来越广。在这里，笔者总结了表观遗传修饰在心衰及心血管疾病治疗方面最新的研究。
1 表观遗传修饰与心力衰竭
1.1 组蛋白的修饰
庞大的真核生物基因组在高度保守的组蛋白的作用下得到了紧密的压缩。在核小体中，基因组DNA围绕核心组蛋白（核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两组）折叠、压缩，形成了染色体的基本单位。基因组DNA与染色体蛋白的相互作用有助于转录因子向靶基因片段聚集，从而调节转录活性[6]。通过这种机制，核小体利用其核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修饰。核心组蛋白的氨基末端从染色质丝上伸出来，与DNA或其他组蛋白、蛋白质等相互作用。该末端上的赖氨酸、精氨酸残基是组蛋白修饰的主要靶点。多数研究旨在了解赖氨酸乙酰化、甲基化的作用。事实证明，赖氨酸的乙酰化作用主要与染色质亲和力及转录相关，而赖氨酸的甲基化作用取决于何种残基被修饰。
有趣的是，正如Mano所总结的那样，组蛋白乙酰化的调控与心肌肥厚相关。去氧肾上腺素可诱导心肌细胞肥大，这一过程需要乙酰基转移酶介导的组蛋白乙酰化。与此结果相一致的研究是针对Ⅱ类组蛋白去乙酰基酶（HDACs）5、9的研究，其通过抑制心肌细胞增强因子2（MEF2）的活性进一步阻碍致肥厚基因（pro-hypertrophic genes）的表达来发挥抗肥厚的作用。与此相反，Ⅰ类HDACs具有相当强的致肥厚作用，其通过调节磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表达发挥作用。这意味着，HDACs在多水平上控制肌肉细胞的体积。
1.2 DNA甲基化
在真核生物中，DNA甲基化是通过将甲基团转移到核苷酸胞嘧啶环的5''位碳原子上完成的。在哺乳动物体内，DNA甲基化主要发生在基因的5''-CG-3''序列，也指的是CpG双核苷酸；人体内，大约70%的CpGs发生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于许多基因的5''端调控区域，以CpG岛的形式出现。与其他DNA区域相比，CpG双核苷酸在CpG岛出现的概率较高。人体内CpG岛甲基化的不同是表观遗传学改变的组成部分。
DNA胞嘧啶甲基化有助于局部转录因子复合物的结合，其与组蛋白修饰共同在局部及整个基因组中影响染色体的结构。因此，DNA甲基化的一个重要作用是调控基因的表达。在这方面，CpG岛超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因发生转录。有人认为，甲基化是一种稳定遗传的修饰，但同时它也受到环境因素的影响。如小鼠野鼠色基因位点，可以受到其上游转座子甲基化状态的影响。从遗传角度来讲，完全相同的亲代其野鼠色基因不同的甲基化状态可使得后代出现不同的毛色[7]。
最近，Kao等[8]的研究结果发现，DNA甲基化在心衰特定的基因转录调控中发挥作用。他们发现促炎症基因TNF-α可下调肌浆网Ca2+-ATPase（SERCA2A）的表达，这是通过增强SERCA2A启动子的甲基化状态完成的。Movassagh等[9]发现，在心肌病及人类心肌组织形成时甲基化的状态是不同的。而且，他们鉴别出三个基因位点（IECAM1、PECAM1、AMOTL2），在不同的心脏样本中，位点甲基化状态与基因表达的调控密切相关。
1.3 MicroRNAs
MicroRNAs是短的双链RNA分子，来源于细胞核及细胞质中较大的RNA前体，其可以在基因转录后对基因表达发挥调节作用。miRNAs可以对30%～50%的蛋白质编码基因进行调控，这一过程主要是通过与mRNA3''端未转录区域的碱基对进行互补结合，继而干扰转录，靶mRNAs可降解或暂时沉默[10]。miRNAs调节蛋白的表达是非常复杂的，多种miRNAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一种miRNAs的调节。miRNAs的表达具有组织、疾病特异性。近年来，多种病理状态下的miRNA分子标记已被检测出来，如各种类型的肿瘤以及多种心血管疾病[11]。
越来越多的证据表明，miRNAs与基本的细胞功能密切相关。目前，miRNAs与心衰的关系已得到明确，在过去的几年中，该领域的报道层出不穷。对心血管疾病的研究主要集中于两种心脏组织特异表达的miRNA家族（miRNA-1/miRNA-133、miRNA-208）。多项研究显示，miRNA在健康、高血压以及不同病因所导致的人、小鼠、大鼠衰竭的心脏中均有表达，Divakaran等[12]发现心脏特异性的miRNA-208不仅可调节心肌细胞肥大、纤维化同时可在应激、甲退时调节β-肌球蛋白重链（β-MHC）的表达。这种miRNA由α-MHC基因的内含子编码。该基因编码α-MHC及一种主要的心肌收缩蛋白，使心脏变大，在应激以及激素信号作用下通过miRNA-208及其作用位点发挥调节作用。再者，定向删除心肌特异性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它们在心脏中的多种功能，包括调节心脏的形态发生、电信号传导及细胞周期的调控。Thum等[13]发现，受损心肌中miRNA标记与胚胎心中miRNA表达的类型极为相似，这说明受损心肌中重启了胚胎基因的表达程序。Thum等[13]另一个发现是miRNA-21可以调控ERK-MAP激酶途径，这种调控在心脏成纤维细胞中尤为明显，心肌细胞中却没有这种表现，这可以影响到心脏的结构及功能。在成纤维细胞中，miRNA-21水平的增高可通过抑制特定基因来激活ERK激酶，经由这种机制，miRNA-21调节了间质纤维化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心脏成纤维细胞中，基因调节的另一种方式是在miRNA介导的旁分泌水平上进行的。
miRNA在心脏肥厚反应中的意义得到了进一步的研究，miRNA成为基因调控的主要调节因子。到目前为止，miRNA已被证实不仅可以影响心肌，还可以影响心脏电信号转导及调节血管再生[14]。
2 表观遗传筛选方法
表观基因组学示意图不是固定的，它因细胞类型、时间的不同而不同，并且可在生理学、病理学、药物作用情况下发生改变。因此，作为人类基因组计划的后续工程，表观基因组测序是一项艰巨的任务。虽然判断基因组序列的表观遗传学状态是比较容易完成的，描绘整个表观基因组需要对数十个基因组进行测序，覆盖一个有机体在生命不同阶段的所有细胞类型。
亚硫酸氢盐测序法是标测DNA甲基化类型最为准确的方法。基因组DNA与亚硫酸氢钠相作用，导致未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。为观察特定基因的甲基化状态，用特异性引物对目的片段进行扩增，随后对产物测序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被标记为Cs，未甲基化的胞嘧啶为Ts。
近来出现了多个对甲基化进行定位的全基因组研究方法，它们都是以甲基化和未甲基化的CpGs对限制性内切酶的敏感性不同为基本原理的。限制长度的基因组扫描利用两种酶双酶切DNA，一种是频繁切割的甲基化非敏感性限制内切酶，另一种是罕见的甲基化敏感性的酶如Not1，这种酶只有在非甲基化状态时才可以酶切所识别的位点。还有一种完全不同全基因组研究方法是利用DNA芯片技术，它可以一次性标测成千上万的CpG岛的甲基化状态。这种方法可以用来识别CpG岛，相对于正常的调控过程来说，CpG岛在肿瘤组织中发生甲基化。
亚硫酸盐转化的替代方法是ChIP-seq方法（一种与测序相结合的染色质免疫沉淀方法）。通过免疫共沉淀技术使得目的蛋白与DNA发生交联，然后对DN段进行基因组测序。这一方法可以帮助识别任何DNA相关蛋白的DNA结合位点。该技术还可以提供组蛋白修饰的信息，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修饰。对ChIP技术进行改进得到的DCS方法，是将ChIP与消减式PCR进行偶联。该方法旨在避免基因组片段与芯片杂交后产生非特异性信号。
以同样的方式可以检测人体病理状态下miRNA的作用，大多数研究是利用高通量的方法分析临床病例中总miRNA的表达情况。高通量技术是以miRNA基因芯片和real-time RCP为代表的。尽管分子间的差别给这些技术带来了巨大的挑战，但miRNA芯片最大的优点是具有很高的特异性，而缺陷是其敏感性较低。
3 药物可以改变表观遗传状态
表观遗传学改变正常及疾病状态下的表型，这可能意味着充分理解和调控表观基因组对于人类常见疾病的防治具有重要意义。表观遗传学为我们提供了一个重要的窗口，来认识环境与基因在疾病发生过程中的相互作用以如何调节这些作用达到改善人类健康的目的。
miRNA派生的反义寡核苷酸是单链RNA分子，对其进行化学修饰可能是针对致病miRNA新的方法。但是这种方法困难重重，miRNA属于密切相关的家族，且很难合成针对每一种miRNA的反义寡核苷酸。再者，一个单独的miRNA可针对多种基因发挥作用，它们之中可能含有对心肌有益的分子。在这方面，寡核苷酸的化学修饰可能会特异性破坏miRNA与单个mRNA的作用，这可能是疾病治疗良好的备选方案。每一种miRNA可以以不同的强度针对成百上千的基因发挥作用，所以在体内miRNA修饰的最终作用尚不明了。最终，将miRNA拮抗剂应用于临床领域将面临很多困难，这与我们在基因治疗方面所遇到的极为相似，如导入方式、载体、特异性以及毒性等问题[15]。至少在理论上，针对特异性miRNA的方法将来可能是治疗缺血性心脏病、心肌肥厚、心衰、血管再生、离子通道病的有效手段，可控制心衰的发展。
另一种方法可能是将靶DNA甲基化。一些影响基因组DNA甲基化的化学合成剂已经应用于临床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基转移酶的氮胞嘧啶可以使DN段脱氨基。其它药物是通过阻碍甲基化酶的活性而发挥抑制甲基化作用。更多信息可参照Gomez等[16]的文章。除了要开发可以调节DNA甲基化的药物外，还需要设计可以影响组蛋白修饰的药物。
在抗肿瘤药物的发展过程中，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂占据着重要地位，它可以通过逆转与肿瘤相关的异常表观遗传改变，继而发挥作用。已有证据表明，在心肌肥厚时，HDAC抑制剂可修复基因表达程序。Gallo等证明体外试验中，曲古霉素A、丁酸钠可延缓心脏肥厚。
4 表观遗传学和环境
众所周知，环境因素如毒素、饮食可以影响DNA甲基化和染色质修饰，并且可遗传给下一代。雌激素、抗雄激素类物质可改变DNA甲基化状态降低男性的生育能力，这也是可遗传的。该假说认为，环境因素可以改变表观遗传学标记和基因表达形式，这可能在人类疾病研究中具有重要意义。常见疾病大多受到基因和环境因素的双重影响，环境可诱导表观遗传结构发生改变，进而将基因和环境因素联系起来[17]。
年龄在基因与环境相互作用中发挥重要作用。常见病的发病率随着年龄的增加不断增高，这与在人的一生中表观遗传学改变不断累积有关。有研究发现，相对于年轻者而言，年长的同卵双胞胎体内总DNA甲基化及组蛋白H3K9乙酰化的水平较高，但该研究没有检测同一个体中表观遗传学改变随时间变化的情况。
5 结论
表观遗传学为研究个体在临床疗效、药物反应及毒性间的差异，以及发现新的药物治疗靶点等方面开拓了更为广阔的空间。随着人类表观基因组工程的开展，表观遗传学机制得到不断完善，这有助于更为充分地了解人类疾病和表观遗传药物的一系列分子靶点。表观遗传药理学已被应用于肿瘤学领域，对于心血管疾病的表观遗传学研究不断增多，尤其是在miRNA方面的研究最为突出。Mishra等[18]清楚地描述了心血管疾病微观RNA组学的最新进展，以及miRNA作为一种潜在治疗靶点或药物制剂的前景。
表观基因组学在健康或疾病状态下表现型的形成过程中发挥重要作用，这可能意味着充分认识和合理调控表观基因对于人类常见病的防治具有重要意义。
[参考文献]
[1] De Boer RA，Van der Harst P，van Veldhuisen DJ，et al. Pharmacogenetics in heart failure：promises and challenges [J]. Expert Opin Pharmacother，2009，10（11）：1713-1725.
[2] Codd V，Mangino M，Van der Harst P，et al. Common variants near TERC are associated with mean telomere length [J]. Nat Genet，2010，42（3）：197-199.
[3] Newton Cheh C，Johnson T，Gateva V，et al. Genome-wide association study identifies eight loci associated with blood pressure [J]. Nat Genet，2009，41（6）：666-676.
[4] Margulies KB，Bednarik DP，Dries DL，et al. Genomics，transcriptional profiling，and heart failure [J]. J Am Coll Cardiol，2009，53（19）：1752-1759.
[5] Peedicadyl J. Pharmacoepigenetics and pharmacoepigenomics [J]. Pharmacogenomics，2008，9（12）：1785-1786.
[6] Mano H. Epigenetic abnormalities in cardiac hypertrophy and heart failure [J]. Environ Health Prev Med，2008，13（2）：25-29.
[7] Ball MP，Li JB，Gao Y，et al. Targeted and genomescale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells[J]. Nat Biotechnol，2009，27（5）：361-368.
[8] Kao YH，Chen YC，Cheng CC，et al. Tumor necrosis factor-alpha decreases sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expressions via the promoter methylation in cardiomyocytes [J]. Crit Care Med，2010，38（1）：217-222.
[9] Movassagh M，Choy MK，Goddard M，et al. Differential DNA methylation correlates with differential expression of angiogenic factors in human heart failure [J]. Plos One，2010，5：8564.
[10] Schroen B，Heymans S. MicroRNAs and beyond：the heart reveals its treasures [J]. Hypertension，2009，54（6）：1189-1194.
[11] Silvestri P，Di Russo C，Rigattieri S，et al. MicroRNAs and ischemic heart disease：towards a better comprehension of pathogenesis，new diagnostic tool and new therapeautic target [J]. Recent Pat Cardiovasc Durg Discov，2009，4（2）：109-118.
[12] Divakaran V，Mann DL. The emerging role of microRNAs in cardiac remodeling and heart failure [J]. Circ Res，2008，103（6）：1072-1083.
[13] Thum T，Cross C，Fiedler J，et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts [J]. Nature，2008，456（7224）：980-984.
[14] Zorio E，Medina P，Rueda J，et al. Insights into the role of microRNAs in cardic diseases：from biological signaling to therapeatic targets [J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2009，7（1）：82-90.
[15] Puceat M. Pharmacological approaches to regenerative strategies for the treatment of cardiovascular diseases [J]. Curr Opin Pharmacol，2008，8（8）：189-192.
[16] Gomez A，Ingelman SM. Pharmacoepigenetics：its role in interindividual differences in drug response [J]. Clin Pharmacol Ther，2009，85（4）：226-230.
作为模因传播的主要途径，语言从模因理论发展的初期就受到了关注。本文选取了语言研究的另一个方面：第二语言习得，寻找第二语言中的模因。一方面，期望带动模因论在语言方面更广泛的研究，另一方面，希望从新的视角为第二语言习得研究提供一些佐证和思路。
一、复制因子特征
从根本上来说，作为社会科学中的复制因子，模因的作用和特征等同于生命科学中的复制因子——基因。虽然各个社会科学领域中的模因各不相同，但作为复制因子它们都具有以下三个总体特征：长寿命、易复制和高保真(Dawkins,1976)。
长寿命、易复制和高保真这三个特点缺一不可，层层相扣。长寿命是基本首要条件，复制能力再强、保真度再高，如果没有足够的时间进行复制和拷贝，复制模因不可能得以传播。复制能力为中间环节，强复制能力一方面可增强长寿性，另一方面也是保真度得以区别的前提，复制能力不强，保真度再高也构不成传播所需的基数。保真度作为最后一个环节虽然使得复制因子条件更为严格，但它无疑在使复制因子的传播功能发挥更大作用的同时，又将长寿命和易复制这两个特征保持得更加完善。因此，三个特点相互依存，形成循环，共同促进复制因子的传播作用。
根据模因符合复制因子特征情况的不同，从力量上可以将模因分为强势模因和弱势模因；从结构上可以将模因分为单个模因和模因组；从表现形式上又可以分为基因型和表现型(Dawkins，1976)。
二、二语习得中具有复制因子特点的语言因子
成为符合模因学的复制因子，二语语言因子首先需要满足三个特征：长寿命、易复制和高保真。现有的二语习得研究中最能体现这三个特征的是有关套话和同义词的研究。
二语习得中对于套话的研究一直处于边缘地段。虽然这种现象一直是学术界研究的兴趣之所在，但始终没有形成一个完整的模型。现阶段对于套话最为认同的定义是：一序列提前预制的连续或非连续的词或其它元素，可以作为整体储存在记忆中，并在需要使用的时候提取，而不需要依据语法去生成和分析(Wary2002)。
对这些现象的研究前提就在于他们的持久以及频繁出现。因此，复制因子的长寿命和易复制的特点对于套语而言是无需证明的。定义上“整体”一词的出现无疑证明了高保真的特点。虽然套语中包含不连续词块(so...that)，但是套语所引出的可变成分并不影响它在使用时的一致性。这一点也可以用模因学中基因型和表现型的概念加以解释。基因型是基本机构和功能，表现型是具体根据语言环境进行的实际使用和改变。已总结出来的词块的特点中有与模因特点相似的，如广泛使用、形式上的样性和不可变性等等。综上所述，套语符合复制因子特点。
长期以来的二语词汇教学中有一种经久不衰的教学方式：同义词记忆。单词背诵的相关教材中不乏将同义词放在一起以提高学习者学习效率的举措。另外一种不按照字母顺序学习词汇的方法是将一个主题的单词归结到一起，这是很多教科书编写时的出发点。两种方法都已经在人的认知领域等方面得到了考察，而模因论从模因组出发也可清晰地揭示其中的原因。单个单词在语言中的存在必然是经历了长期的考验(长寿命)，同时除拼写错误外不会在本身的构成上出现任何改变(高保真)。也就是说，单词的易复制这一特点决定了其成为模因的力量强弱。组合在一起有相关联系的模因组较之单个的模因有更高的复制和传播速度。组内的各个模因是相互联系着的，其中一个的使用能从整体上带动所有模因组内模因的复制和传播。从模因学的角度来说，这种记忆的高效率是因为组合在一起的同义词和同话题词是更为强势的语言模因。
第二语言习得中的套话现象以及同义词、同话题记忆的高效率保证了模因理论引入的第一个条件：他们可以作为具有复制因子特点的第二语言模因。第二语言习得中的语言因子可从模因论的角度描述如图1所示。
上图给出了三种符合复制模因特点的第二语言模因组。从纵向上讲有两种，其一，同义词之间由同一主题连接形成的模因组；其二，同一话题间由这一话题联系在一起形成模因组。对于这两种模因组而言，所包含的模因越多，就越稳定，某一意义或话题中的语言因子就更有可能成为强势模因。
除纵向上的两种模因组以外，横向上通过各种连接词将纵向上模因组中的模因结合起来，形成另外一种模因组：固定的词块形式。对词汇短语的分类表明，词块形式的定义应不仅限于聚合词语，限制性结构短语等短语层面上的结构。从句子层面上，它还包括约定俗成的表达结构和句子构造型短语；从段落和文章层面上，它更包括组成结构以及逐字的用于引用的文章。还有一点值得强调的是，这些搭配虽然具有复制模因高保真的特点，但从图1中可以清晰地发现这种搭配的组合形式是可变的、可选择的。这一点说明基因型和表现型保证模因理论指导下通过模仿掌握的语言同样可以正确且灵活地使用。对于这一种模因组而言，组合方式越多，就越稳定，某种表达方式中的语言因子同样也就更有可能成为强势模因。
应该说所有存在的二语习得因子都应存在于相互连接的模因组中。联系方式的多少和强弱决定了他们作为模因传播的机率。在第二语言习得中应首先向习得者介绍更为强势的语言模因，同时指导习得者将其二语模因库中的模因有效组合起来。一方面，词块的预先设置性使得产出时处理负担降低，这不仅可保证语言使用正确率的提高，还可节省出大量时间考虑除选词外的语境、语法等等，提高了学习者的交际水平。另一方面，同义词和同话题词的换用可以保证学习者达到英语要求的语言使用多样性和非重复性。
三、结论
二语习得环境中有符合模因条件的语言因子，将模因理论引入到二语习得研究中来从理论上是可行的。从模因学的角度，第二语言习得的首要任务就是选择具有第二语言模因特点的语言因子进行习得，将他们以模因组的形式排列起来，以达到最佳的习得状态。
参考文献：
[1]Wray,Alison.2002.FormulaicLanguageandtheLexicon[C].Cambridge：CambridgeUniversityPress.
作为模因传播的主要途径，语言从模因理论发展的初期就受到了关注。本文选取了语言研究的另一个方面：第二语言习得，寻找第二语言中的模因。一方面，期望带动模因论在语言方面更广泛的研究，另一方面，希望从新的视角为第二语言习得研究提供一些佐证和思路。
一、复制因子特征
从根本上来说，作为社会科学中的复制因子，模因的作用和特征等同于生命科学中的复制因子——基因。虽然各个社会科学领域中的模因各不相同，但作为复制因子它们都具有以下三个总体特征：长寿命、易复制和高保真(Dawkins，1976)。
长寿命、易复制和高保真这三个特点缺一不可，层层相扣。长寿命是基本首要条件，复制能力再强、保真度再高，如果没有足够的时间进行复制和拷贝，复制模因不可能得以传播。复制能力为中间环节，强复制能力一方面可增强长寿性，另一方面也是保真度得以区别的前提，复制能力不强，保真度再高也构不成传播所需的基数。保真度作为最后一个环节虽然使得复制因子条件更为严格，但它无疑在使复制因子的传播功能发挥更大作用的同时，又将长寿命和易复制这两个特征保持得更加完善。因此，三个特点相互依存，形成循环，共同促进复制因子的传播作用。
根据模因符合复制因子特征情况的不同，从力量上可以将模因分为强势模因和弱势模因；从结构上可以将模因分为单个模因和模因组；从表现形式上又可以分为基因型和表现型(Dawkins，1976)。
二、二语习得中具有复制因子特点的语言因子
成为符合模因学的复制因子，二语语言因子首先需要满足三个特征：长寿命、易复制和高保真。现有的二语习得研究中最能体现这三个特征的是有关套话和同义词的研究。
二语习得中对于套话的研究一直处于边缘地段。虽然这种现象一直是学术界研究的兴趣之所在，但始终没有形成一个完整的模型。现阶段对于套话最为认同的定义是：一序列提前预制的连续或非连续的词或其它元素，可以作为整体储存在记忆中，并在需要使用的时候提取，而不需要依据语法去生成和分析(Wary 2002)。
对这些现象的研究前提就在于他们的持久以及频繁出现。因此，复制因子的长寿命和易复制的特点对于套语而言是无需证明的。定义上“整体”一词的出现无疑证明了高保真的特点。虽然套语中包含不连续词块(so ... that)，但是套语所引出的可变成分并不影响它在使用时的一致性。这一点也可以用模因学中基因型和表现型的概念加以解释。基因型是基本机构和功能，表现型是具体根据语言环境进行的实际使用和改变。已总结出来的词块的特点中有与模因特点相似的，如广泛使用、形式上的样性和不可变性等等。综上所述，套语符合复制因子特点。
长期以来的二语词汇教学中有一种经久不衰的教学方式：同义词记忆。单词背诵的相关教材中不乏将同义词放在一起以提高学习者学习效率的举措。另外一种不按照字母顺序学习词汇的方法是将一个主题的单词归结到一起，这是很多教科书编写时的出发点。两种方法都已经在人的认知领域等方面得到了考察，而模因论从模因组出发也可清晰地揭示其中的原因。单个单词在语言中的存在必然是经历了长期的考验(长寿命)，同时除拼写错误外不会在本身的构成上出现任何改变(高保真)。也就是说，单词的易复制这一特点决定了其成为模因的力量强弱。组合在一起有相关联系的模因组较之单个的模因有更高的复制和传播速度。组内的各个模因是相互联系着的，其中一个的使用能从整体上带动所有模因组内模因的复制和传播。从模因学的角度来说，这种记忆的高效率是因为组合在一起的同义词和同话题词是更为强势的语言模因。
第二语言习得中的套话现象以及同义词、同话题记忆的高效率保证了模因理论引入的第一个条件：他们可以作为具有复制因子特点的第二语言模因。第二语言习得中的语言因子可从模因论的角度描述如图1所示。
上图给出了三种符合复制模因特点的第二语言模因组。从纵向上讲有两种，其一，同义词之间由同一主题连接形成的模因组；其二，同一话题间由这一话题联系在一起形成模因组。对于这两种模因组而言，所包含的模因越多，就越稳定，某一意义或话题中的语言因子就更有可能成为强势模因。
除纵向上的两种模因组以外，横向上通过各种连接词将纵向上模因组中的模因结合起来，形成另外一种模因组：固定的词块形式。对词汇短语的分类表明，词块形式的定义应不仅限于聚合词语，限制性结构短语等短语层面上的结构。从句子层面上，它还包括约定俗成的表达结构和句子构造型短语；从段落和文章层面上，它更包括组成结构以及逐字的用于引用的文章。还有一点值得强调的是，这些搭配虽然具有复制模因高保真的特点，但从图1中可以清晰地发现这种搭配的组合形式是可变的、可选择的。这一点说明基因型和表现型保证模因理论指导下通过模仿掌握的语言同样可以正确且灵活地使用。对于这一种模因组而言，组合方式越多，就越稳定，某种表达方式中的语言因子同样也就更有可能成为强势模因。
应该说所有存在的二语习得因子都应存在于相互连接的模因组中。联系方式的多少和强弱决定了他们作为模因传播的机率。在第二语言习得中应首先向习得者介绍更为强势的语言模因，同时指导习得者将其二语模因库中的模因有效组合起来。一方面，词块的预先设置性使得产出时处理负担降低，这不仅可保证语言使用正确率的提高，还可节省出大量时间考虑除选词外的语境、语法等等，提高了学习者的交际水平。另一方面，同义词和同话题词的换用可以保证学习者达到英语要求的语言使用多样性和非重复性。
三、结论
二语习得环境中有符合模因条件的语言因子，将模因理论引入到二语习得研究中来从理论上是可行的。从模因学的角度，第二语言习得的首要任务就是选择具有第二语言模因特点的语言因子进行习得，将他们以模因组的形式排列起来，以达到最佳的习得状态。
参考文献
[1]Wray， Alison. 2002. Formulaic Language and the Lexicon[C]. Cambridge： Cambridge University Press.
1 证候动物模型研究现状及建议
证候动物模型的研究源于20世纪60年代，经过近半个世纪的努力探索、研究与积累，硕果累累。据统计，目前证候模型多达200余种，给中医药现代化的研究奠定了一定的基础，也是中医走向现代化的第一次突破，在中医现代化史上具有里程碑的意义。然而，回顾证候模型的复制方法，大体上是依据以下2条原则进行造模：①依据中医理论病因病机学说造模，如限制饮食法复制气虚证模型、放血法复制气血两虚证模型、寒冷环境下复制实寒证模型等；②依据中药或西药的药理作用造模，如大黄或番泻叶复制的脾虚证模型、右旋糖苷复制的血瘀证模型、氢化可的松复制的肾阳虚证模型等。以上模型似乎符合中医“病因-病机-证候”学说形成机制，但笔者不完全赞同以上单一线性的因果证候模型形成机制。理由是：模型的载体即动物存在个体差异，因为哪怕是近交系甚至是同卵双胞胎也存在个体差异，因而相同的致病因素作用于不同体质的个体动物上，其产生的效应是不一致的，即证候表现不一致。因此，笔者认为，“通常认为采用某一或若干因素干预动物后形成某某证候”这种说法不妥。
既然如此，动物的证候又如何来确定呢？笔者认为，这涉及到再辨证问题，即同一造模因素复制的证候模型需要再辨证！回顾临床，我们可以深刻地体会到，在同一环境下感受相同寒邪后，不同机体会出现风热证或风寒证，表实证或表虚证；同样，在同类型肿瘤不同患者中，接受同一化疗方案后，个体表现的证候是不一致的，有脾气虚、肾阴虚，还有脾胃不和、阴阳两虚等差异；此外，不同动物对相同刺激可有不同的反应，不同品系及其亚系动物对同一药物反应也有差异。因此，笔者认为，目前证候模型的研究中最需学术界关心的是——造模后再辨证的问题，而不是停留在造模因素上的分歧，也不必强调一定要在中医基础理论指导下造模。
既然提出要对动物实施中医辨证，就必须建立实验动物的证候采集标准、辨证标准。目前，这方面工作国内开展不多。上海中医药大学国家中医药管理局中医基础理论重点学科方肇勤教授课题组从1999年开始探索，历经近10年的艰苦探索与反复研究，取得了一定的成绩，先后建立起了“小鼠四诊工作站构建与操作标准”、“小鼠四诊采集项目标准”、“小鼠常见证候的辨证标准”、“大鼠/小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价”，并编著《辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证》专著[1-5]。但我们深知这仅仅是起步，许多内容尚需深入挖掘与研究。关于实验动物中医辨证研究，国内部分学者也认识到这一问题的重要性，如宋氏[6]认为，对证候本质的研究必须从动物证候学入手，研发相关的技术，制定相应的评价标准，对现有的疾病模型动物进行中医辨证。我们希望学术界同仁对此一起探索，以推动证候模型的进一步发展。
2 证候的现代概念
近年来，随着国家对中医现代化研究投入力度的加大，证候病机的物质基础研究热浪滚滚，由此以来，证候概念的现代内涵也蕴育而生，如沈氏[7]把“证”定义为“是一种综合性功能态，有具体的功能网络和调控中心”。申氏[8]认为，证是属于现代医学理论中的病理生理过程和临床综合征。王氏[9]认为，证是有其本质的，辨证是有一定分子生物学的基础，论治是有针对性地调整某些基因或一组基因，及其功能的表达状态。王氏[10]认为，中医证本质极为复杂，是一种多基因参与和调控的，具有时空性、系统性及层次性的临床症候群。张氏等[11]把“证”描述为“是中医关于人体在疾病状态下信息的综合征象；是对人体在疾病发生、发展过程中某一时段性生理、病理的概括；是中医学辨证论治的主体”。宋氏[6]认为，证候是通过四诊手段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因素(包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子)的整体性反应而呈现的生理、病理信息的综合判断结果的表述。证候也可简称反应态，且具有整体性、时空性、传变性和个体差异性等特点。王氏[12]提出，任何一种证候都是由若干证候要素和证候要素靶位组成，其中证候要素是对证候病因病机的表述，证候要素靶位是关于证候要素发生部位的厘定。并认为，任一证候要素或证候要素靶位都具有不同于其他证候要素或证候要素靶位的特异性症状、体征及其组合。罗氏等[13]基于证候代谢组学的研究，提出“证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态，其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群，其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变”。
以上证候概念的现代化语言表述，是建立在国内许多知名学者对证候实验研究基础之上，它以实验数据来支撑。尽管未能达成一致见解，但这恰好说明了证候研究处于蓬勃发展时期，导致不同学者在已有研究成果上赋予证候不同的内涵，呈现一派百家争鸣的学术气氛。同时，体现了学术界认识到证候的发生有其客观的物质基础，采用现代医学技术可以挖掘出证候的本质。然而，证候病机的物质基础，即其分子指标有无特异性？一个证候是否就是由某一特定的分子决定，还是由一群相关联的各种生物标志物共同构成的呢？笔者认为，采用现代系统生物学技术，如高通量的基因芯片、蛋白质芯片等筛选方法可以得到较为客观、翔实的答案。
3 现代系统生物学技术在证候本质研究中的近况
在证候本质的实验研究上，以往学术界对证候的微观指标进行了不懈的探索。早期研究最多的是生化指标，比如脾虚模型观测指标就多达70项，其中比较公认的有酸刺激后唾液淀粉酶活性下降和木糖吸收率下降两项，但临床实际意义不大。以后过渡到目标基因的检测，如吴氏等[14]研究发现p53、Bcl-2蛋白是结肠癌脾虚证的相关基因。胡氏等[15]发现，从脾胃气阴两虚兼气滞到兼胃热再到兼血瘀，p21ras、c-erbB-2、p53癌基因的表达逐渐增加。既往的这些微观指标研究总体而言呈现主观、分散、非特异性等特征，不能全面、客观、真实地反映证候的本质。因而，目前需要借助于高通量的基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统生物学技术来研究，这为中医证候本质的研究提供了新的技术平台。
3.1 基因组学技术在证候研究中的运用
基因组学由美国科学家Thomas Roderick于1986年提出，是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱和转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学，基因组学可分为结构基因组学、比较基因组学和功能基因组学。目前，研究最广泛的是功能基因组学。
基因组学能否用于中医证候本质的研究？站在科学最前沿的科学家总是看得最清楚的。在基因芯片技术刚引入国内时，杨氏[16]就认为，要使西医的病与中医的证统一起来，基因表达谱也许将是重要的连结点。宋氏等[17]认为，以基因组学作为中医现代化切入点的时机已经成熟，基因组学正是中医药现代化的最佳切入点。沈氏[18]认为，遵循中医学研究本身的内在规律，充分利用功能基因组学的研究成果，建立中医证的表达谱，将是21世纪中医药学的主要发展趋势。方氏[19]认为，在疾病模型基础上通过辨证，再对主要的病变组织利用基因芯片技术检测，可以了解证与证、证与病、证与体质之间的差异，并揭示证和辨证论治在基因水平上的机制与因果关系。尽管目前这方面的具体研究成果不多，但已开拓了我们的视野。
王氏[20]采用基因芯片技术对人类证候进行了研究，并获得了一批差异基因表达数据，如用18000个点的基因芯片从肾阳虚证患者和正常人的比照研究之中筛选出差异表达基因1950条；用基因芯片技术对同一家系中虚寒证患者和正常人进行基因表达谱检测，发现此虚寒证家系中虚寒证患者与能量等代谢相关的差异表达基因达15个。高氏等[21]检测糖尿病家系中肾阴阳两虚血瘀证糖尿病患者与同家系中正常人，发现差异基因446条，其中包括与代谢、细胞凋亡、细胞周期、糖尿病相关基因和与传统中医理论肾的功能、血瘀相关基因。王氏等[22]应用基因芯片技术研究证实，脾虚证实质涉及大脑皮层和海马的基因表达谱改变，但与大脑皮质比较海马的基因表达改变少。盛氏等[23]观察了DEN诱发大鼠肝癌过程中，不同时期与不同治法对肝脏基因芯片表达特征，发现在芯片的15710个基因中，正常组有9225个基因表达，诱癌4周表达增至9396个，8周增至9872个，16周增至10496个，20周有10420个。此外，潘氏等[24]进一步对不同证候的H22肝癌荷瘤小鼠进行了外显子芯片检测，发现不同证候小鼠肾上腺等组织有大量的独特差异表达基因，如筛选阳气虚证独特上调基因52条、独特下调基因11条；气阴阳虚证独特上调和下调基因分别为23条和4条。
以上芯片结果获得部分差异基因，但目前对这些差异基因的比较、分析、验证、重复等后续报道较少。笔者认为，考虑到基因芯片数据海量，研究者重点关注的是不同证候特征性差异表达基因，基于不同证候与正常的比值差异及基因的相对表达量(芯片读数计算值)这2个基本条件，去筛选证候形成的主效应基因，然后开展后续的验证研究才是基因组学技术在证候本质研究中的价值所在，对阐明证候的物质基础才具有真实的学术意义。
3.2 蛋白质组学技术在证候研究中的运用
蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams于1994年首先提出的。蛋白质组是指一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，它研究不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，以揭示生命活动的基本规律。
蛋白质组学技术能否应用于中医证候本质的研究呢？余氏等[25-26]分别从认知和技术的可行性分析，认为蛋白质组学与中医辨证论治的认识方法相似，是从整体的角度出发，分析细胞内所有动态变化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态，是从基因层面向蛋白质层面的深化，有利于动态地揭示同一个研究对象不同时期的变动性，更符合证候的特点。目前，蛋白质组学技术在中医证候研究是一个新的热点。例如，马氏等[27-28]用蛋白质组学技术研究四物汤对60Co γ射线造成血虚证小鼠血清蛋白和骨髓蛋白的影响，发现四物汤可使血虚证小鼠血清中12个下调的蛋白点和4个上调的蛋白点有所恢复，可逆转血虚证小鼠骨髓10个上调和5个下调的蛋白质。梁氏等[29]研究肾阳虚证小鼠，发现了肾脏中大量有代表意义的差异蛋白质点。卢氏等[30]对肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组研究表明，肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关。谢氏等[31]对脂多糖致热毒血瘀证大鼠的血清进行了二维电泳分离分析，发现有13个蛋白点出现非常明显的含量变化。张氏等[32]对高血压肝阳上亢大鼠模型脾的单个核细胞的蛋白质组进行了分析，结果在高血压肝阳上亢大鼠中检测到497个点，其中为其独自所有的点有387个，并认为可能与高血压肝阳上亢证候相关。谭氏等[33]采用蛋白质组学技术研究抑郁症、经前期综合征、更年期综合征3种疾病肝郁证血清指标，结果发现了12个差异蛋白质点及其与疾病的关系。尽管以上不同证候与有关蛋白质的关系被初步发现与阐明，但这些蛋白质能否代表证候的特征、是否具有特异性、重复性又如何等诸多问题尚不能定论，因而笔者建议，学术界对这些蛋白质与证候关系的后续深入研究是重点，以获得可信、稳定、真实的证候物质基础。
3.3 代谢组学技术在证候研究中的运用
代谢组学是英国Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的，它是在机体新陈代谢的动态过程中，系统研究一个细胞、组织或器官所有代谢组分，尤其是分子质量为1000以下小分子的变化规律，以揭示机体生命活动的代谢本质。代谢组学研究的样品通常为血液、尿液等，通过检测其代谢组分以了解体内的异常代谢状态，因而具有整体性、终端性及动态性等特征。目前，代谢组学技术主要用于现代医学及中药现代研究中，如在肿瘤机制研究、冠心病诊断、药物对肝毒性研究等方面的应用；此外，在实验动物模型的评价及外源物产生的一系列代谢过程、作用机制、靶器官的效应、组织损伤等研究中也被应用[34]。
代谢组学作为一门新发展的技术，同基因组学和蛋白质组学一样，属于系统生物学的重要组成部分，它能否应用于中医证候本质的研究？王氏等[35]认为，代谢组学对证候模型的评价起到客观化作用，通过建立动物体液的“代谢指纹图谱”，在主成分分析法基础上，比较证候模型动物的体液代谢图谱，分析代谢模式差异性，有可能寻找到代谢网络缺陷的重要生物标志。相比基因组学和蛋白组学而言，目前，代谢组学技术在中医证候研究案例较少。罗氏等[36]报道，采用超导傅立叶变化核磁共振波谱仪检测肝郁脾虚模型大鼠血浆，对其代谢物组的共性分析和生物标记物进行主成分分析，结果发现，各组动物代谢谱各不相同，肝郁脾虚证大鼠血浆醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。贾氏等[37]采用代谢组学研究肾阳虚模型动物，发现其代谢网络明显偏离正常动物，经温阳中药干预后，肾阳虚动物的代谢谱回归至正常范围，呈现网络修复的结果。
总之，现代系统生物学理论与技术在中医证候本质研究中已被运用，其中基因组学与蛋白质组学技术在证候研究中运用最广泛，可能与基因芯片等技术的成熟、稳定等有关，而代谢组学在证候研究中相对较少。由于基因组学和蛋白质组学研究分别在基因转录和蛋白质层面揭示可能发生的事件，更具有动态的特征，而代谢组学则反映确实已经发生了的事情，突出机体整体性与终端特征。因而笔者建议，在证候本质的研究中，将这3种“组学”技术联合运用，将对证候本质的阐明具有十分重要的学术意义。
4 展望
中医证候本质的研究是一项长期、艰巨又重大的关键科学问题。纵观以往中医药工作者的研究积累，我们可以清楚地看出，不少中医药工作者已提出了系统生物学技术在证候研究中的思路[38-41]，业已开展了证候本质的探索。但目前尚处于研究的前期阶段，重复且可靠的证候物质基础尚未发现，一些报道与证候有关的散在分子指标可能尚具有组织特异性。
那么，如何全面揭示证候的客观本质呢？从中医学的整体观、辨证论治思维与系统生物学的学科特点，可以考虑基于以下几点：①“组学”技术不是对个别基因或个别蛋白、代谢物的研究，而是对一个细胞或整个生命体的基因以及它所编码的蛋白质和代谢产物的研究；②基因转录翻译成蛋白质的过程中存在着剪接、加工修饰、构象变化和转运定位等蛋白质活动规律的变化，因而证候的基因转录水平并不能完全代表证候的蛋白质水平状况；③代谢组学强调把机体作为一个完整的系统来研究，符合证候的特征。因而我们推测，证候的物质基础可能是由功能相关的基因群或蛋白质群体表达异常及特异代谢组分共同构成。由此，在证候本质的研究中引入并联合采用基因组学、蛋白质组学和代谢组学等现代系统生物学理论和技术对目标组织同步检测，以获得证候基因表达谱、证候总体蛋白质表达图谱、证候相关代谢群谱，再运用生物信息学技术将这3张图谱与证候进行关联分析，从而更全面、更确切地揭示证候的动态发生机制。
关于证候本质研究的未来发展趋势，我们建议，重点应该围绕“同病异证”和“异病同证”的证候进行整合系统生物学研究，在筛选到证候独特表达的差异基因、差异蛋白及差异代谢组分的基础上，进一步对这些基因、靶蛋白、代谢小分子之间的联系与相互作用进行深入探索，以鉴定证候的本质特征。
参考文献
[1] 方肇勤.辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证[M].上海：上海科学技术出版社，2006.100.
[2] 方肇勤，潘志强，汤伟昌，等.小鼠“四诊工作站”构建与操作标准探讨[J].上海中医药大学学报，2006，20(1)：42－46.
[3] 方肇勤，潘志强，付晓伶，等.小鼠四诊采集项目标准的建议[J].中国中医基础医学杂志，2005，11(9)：692－694.
[4] 方肇勤，潘志强，卢文丽，等.小鼠常见证候的辨证标准[J].中国中医基础医学杂志，2006，12(7)：508－510.
[5] 方肇勤，潘志强，卢文丽，等.大鼠、小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价[J].中国中医基础医学杂志，2007，13(7)：502－505.
[6] 宋剑南.论中医证候基础研究的模式和方法[J].中国中医基础医学杂志，2007，13(2)：81－83.
[7] 沈自尹.我的科研历程和思考[J].中医杂志，2000，41(11)：690－692.
[8] 申维玺.论中医“证”的现代医学属性和概念[J].中医杂志，2001，42(5)：307－309.
[9] 王米渠.中医遗传学[M].西宁：青海人民出版社，1997.245－291.
[10] 王 忠，王 阶，王永炎.后基因组时代中医证候组学研究的思路[J].中国中西医结合杂志，2001，21(8)：621－623.
[11] 张立华，高学功.中医“证”与“辨证”之浅见[J].时珍国医国药， 2002，13(7)：412－413.
[12] 王永炎，张启明，张志斌.证候要素及其靶位的提取[J].山东中医药大学学报，2006，30(1)：627.
[13] 罗和古，陈家旭.代谢组学技术与中医证候的研究[J].中国中医药信息杂志，2007，14(5)：3－5.
[14] 吴苏冬，周冬枝，贾宗良，等.结肠癌脾虚证p53，Bcl-2和Bax的表达[J].第四军医大学学报，2003，24(12)：1111－1113.
[15] 胡 玲，劳邵贤.胃癌前病变p21ras，c-erbB-2，p53表达与中医证候的关系[J].世界华人消化杂志，2004，12(2)：262－265.
[16] 杨焕明.基因组学——中医药学现代化的一个切入点[J].医药世界， 2000，(8)：5－7.
[17] 宋为民，王明艳，徐 力.基因组学是中医现代化的最佳切入点[J].南京中医药大学学报，1999，15(4)：193－195.
[18] 沈自尹.21世纪——中西医结合走向后基因组时代[J].中国中西医结合杂志，2000，20(11)：808－810.
[19] 方肇勤.基因芯片技术现状及其在中医基础实验研究中的应用[J].上海中医药大学学报，2001，15(1)：17－19.
[20] 王米渠，杨丽萍，丁维俊，等.一个寒证家系中发现15个差异表达基因的报告[J].中医杂志，2006，47(2)：131－133.
[21] 高 黝，高 泓，王米渠.1个糖尿病家系肾阴阳两虚血瘀证糖尿病的差异表达基因分析[J].现代中西医结合杂志，2005，14(1)：1－5.
[22] 王 肃，邹世洁，陈小野，等.利血平脾虚证模型海马基因表达谱变化的研究[J].现代中西医结合杂志，2004，13(7)：841－844.
[23] 盛学仕，方肇勤，管冬元，等.DEN诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变[J].中国中医基础医学杂志，2005，11(10)：737－746.
[24] 潘志强，方肇勤，卢文丽，等.阳气虚和气阴阳虚证荷瘤小鼠肾上腺基因表达的差异性[J].上海中医药大学学报，2008，22(3)：45－50.
[25] 余宗阳，杜 建.蛋白质组学与中医证实质研究[J].中国中西医结合杂志，2004，24(9)：844－846.
[26] 杨元宵，李昌煜.运用蛋白质组学研究中医证候的思考[J].中国实验方剂学杂志，2007，13(1)：69－72.
[27] 马增春，高 月，谭洪玲，等.四物汤对辐射致血虚证小鼠血清蛋白质表达的影响[J].中国中药杂志，2003，28(11)：1050－1053.
[28] 郭 平，马增春，李鹰飞，等.四物汤对放射线致血虚证小鼠骨髓蛋白质表达的影响[J].中国中药杂志，2004，29(9)：893－896.
[29] 梁 恒，邢建宇，刘希成，等.小鼠肾脏组织的双向电泳[J].西安交通大学学报，2004，38(2)：212－214.
[30] 卢德赵，沃兴德，施孟如，等.激素型肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组与能量代谢相关性[J].中国生物化学和分子生物学报，2005，21(6)：807－814.
[31] 谢文光，马晓昌，邵宁生，等.赤芍治疗热毒血瘀证的血清蛋白质组变化的初步研究[J].中国中西医结合杂志，2005，25(6)：520－524.
[32] 张 娴，李 伟，曾 星，等.高血压肝阳上亢大鼠模型单个核细胞蛋白质组的二维电泳分析[J].中华中西医杂志，2003，4(13)：1929－1931.
[33] 谭秦湘，吕志平，钟小兰，等.肝郁证辨证与相关蛋白关系初步研究[J].辽宁中医杂志，2006，33(2)：157－158.
[34] 刘昌孝.代谢组学与中药现代研究[J].河南大学(医学版)，2006，25(3)：1－7.
[35] 王桐生，谢 鸣.代谢组学与中医药现代研究[J].中医杂志，2006，47(10)：723－725.
[36] 罗和古，丁 杰，岳广欣，等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[J].中西医结合学报，2007，5(3)：307－313.
[37] 贾 伟，蒋 健，刘 平，等.代谢组学在中医药复杂理论体系研究中的应用[J].中国中药杂志，2006，31(8)：621－624.
[38] 金光亮.证候基因组学和证候蛋白质组学浅论[J].中国医药学报， 2003，18(6)：332－335.
1 证候动物模型研究现状及建议
证候动物模型的研究源于20世纪60年代,经过近半个世纪的努力探索、研究与积累,硕果累累。据统计,目前证候模型多达200余种,给中医药现代化的研究奠定了一定的基础,也是中医走向现代化的第一次突破,在中医现代化史上具有里程碑的意义。然而,回顾证候模型的复制方法,大体上是依据以下2条原则进行造模：①依据中医理论病因病机学说造模,如限制饮食法复制气虚证模型、放血法复制气血两虚证模型、寒冷环境下复制实寒证模型等；②依据中药或西药的药理作用造模,如大黄或番泻叶复制的脾虚证模型、右旋糖苷复制的血瘀证模型、氢化可的松复制的肾阳虚证模型等。以上模型似乎符合中医“病因-病机-证候”学说形成机制,但笔者不完全赞同以上单一线性的因果证候模型形成机制。理由是：模型的载体即动物存在个体差异,因为哪怕是近交系甚至是同卵双胞胎也存在个体差异,因而相同的致病因素作用于不同体质的个体动物上,其产生的效应是不一致的,即证候表现不一致。因此,笔者认为,“通常认为采用某一或若干因素干预动物后形成某某证候”这种说法不妥。
既然如此,动物的证候又如何来确定呢？笔者认为,这涉及到再辨证问题,即同一造模因素复制的证候模型需要再辨证！回顾临床,我们可以深刻地体会到,在同一环境下感受相同寒邪后,不同机体会出现风热证或风寒证,表实证或表虚证；同样,在同类型肿瘤不同患者中,接受同一化疗方案后,个体表现的证候是不一致的,有脾气虚、肾阴虚,还有脾胃不和、阴阳两虚等差异；此外,不同动物对相同刺激可有不同的反应,不同品系及其亚系动物对同一药物反应也有差异。因此,笔者认为,目前证候模型的研究中最需学术界关心的是——造模后再辨证的问题,而不是停留在造模因素上的分歧,也不必强调一定要在中医基础理论指导下造模。
既然提出要对动物实施中医辨证,就必须建立实验动物的证候采集标准、辨证标准。目前,这方面工作国内开展不多。上海中医药大学国家中医药管理局中医基础理论重点学科方肇勤教授课题组从1999年开始探索,历经近10年的艰苦探索与反复研究,取得了一定的成绩,先后建立起了“小鼠四诊工作站构建与操作标准”、“小鼠四诊采集项目标准”、“小鼠常见证候的辨证标准”、“大鼠/小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价”,并编著《辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证》专著[1-5]。但我们深知这仅仅是起步,许多内容尚需深入挖掘与研究。关于实验动物中医辨证研究,国内部分学者也认识到这一问题的重要性,如宋氏[6]认为,对证候本质的研究必须从动物证候学入手,研发相关的技术,制定相应的评价标准,对现有的疾病模型动物进行中医辨证。我们希望学术界同仁对此一起探索,以推动证候模型的进一步发展。
2 证候的现代概念
近年来,随着国家对中医现代化研究投入力度的加大,证候病机的物质基础研究热浪滚滚,由此以来,证候概念的现代内涵也蕴育而生,如沈氏[7]把“证”定义为“是一种综合性功能态,有具体的功能网络和调控中心”。申氏[8]认为,证是属于现代医学理论中的病理生理过程和临床综合征。王氏[9]认为,证是有其本质的,辨证是有一定分子生物学的基础,论治是有针对性地调整某些基因或一组基因,及其功能的表达状态。王氏[10]认为,中医证本质极为复杂,是一种多基因参与和调控的,具有时空性、系统性及层次性的临床症候群。张氏等[11]把“证”描述为“是中医关于人体在疾病状态下信息的综合征象；是对人体在疾病发生、发展过程中某一时段性生理、病理的概括；是中医学辨证论治的主体”。宋氏[6]认为,证候是通过四诊手段获取的机体在某一时空条件下对各种内外因素(包括机体生理功能及生物、化学、环境、精神、气候等各种致病因子)的整体性反应而呈现的生理、病理信息的综合判断结果的表述。证候也可简称反应态,且具有整体性、时空性、传变性和个体差异性等特点。王氏[12]提出,任何一种证候都是由若干证候要素和证候要素靶位组成,其中证候要素是对证候病因病机的表述,证候要素靶位是关于证候要素发生部位的厘定。并认为,任一证候要素或证候要素靶位都具有不同于其他证候要素或证候要素靶位的特异性症状、体征及其组合。罗氏等[13]基于证候代谢组学的研究,提出“证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态,其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群,其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变”。
以上证候概念的现代化语言表述,是建立在国内许多知名学者对证候实验研究基础之上,它以实验数据来支撑。尽管未能达成一致见解,但这恰好说明了证候研究处于蓬勃发展时期,导致不同学者在已有研究成果上赋予证候不同的内涵,呈现一派百家争鸣的学术气氛。同时,体现了学术界认识到证候的发生有其客观的物质基础,采用现代医学技术可以挖掘出证候的本质。然而,证候病机的物质基础,即其分子指标有无特异性？一个证候是否就是由某一特定的分子决定,还是由一群相关联的各种生物标志物共同构成的呢？笔者认为,采用现代系统生物学技术,如高通量的基因芯片、蛋白质芯片等筛选方法可以得到较为客观、翔实的答案。
3 现代系统生物学技术在证候本质研究中的近况
在证候本质的实验研究上,以往学术界对证候的微观指标进行了不懈的探索。早期研究最多的是生化指标,比如脾虚模型观测指标就多达70项,其中比较公认的有酸刺激后唾液淀粉酶活性下降和木糖吸收率下降两项,但临床实际意义不大。以后过渡到目标基因的检测,如吴氏等[14]研究发现p53、bcl-2蛋白是结肠癌脾虚证的相关基因。胡氏等[15]发现,从脾胃气阴两虚兼气滞到兼胃热再到兼血瘀,p21ras、c-erbb-2、p53癌基因的表达逐渐增加。既往的这些微观指标研究总体而言呈现主观、分散、非特异性等特征,不能全面、客观、真实地反映证候的本质。因而,目前需要借助于高通量的基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统生物学技术来研究,这为中医证候本质的研究提供了新的技术平台。
3.1 基因组学技术在证候研究中的运用
基因组学由美国科学家thomas roderick于1986年提出,是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱和转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学,基因组学可分为结构基因组学、比较基因组学和功能基因组学。目前,研究最广泛的是功能基因组学。
基因组学能否用于中医证候本质的研究？站在科学最前沿的科学家总是看得最清楚的。在基因芯片技术刚引入国内时,杨氏[16]就认为,要使西医的病与中医的证统一起来,基因表达谱也许将是重要的连结点。宋氏等[17]认为,以基因组学作为中医现代化切入点的时机已经成熟,基因组学正是中医药现代化的最佳切入点。沈氏[18]认为,遵循中医学研究本身的内在规律,充分利用功能基因组学的研究成果,建立中医证的表达谱,将是21世纪中医药学的主要发展趋势。方氏[19]认为,在疾病模型基础上通过辨证,再对主要的病变组织利用基因芯片技术检测,可以了解证与证、证与病、证与体质之间的差异,并揭示证和辨证论治在基因水平上的机制与因果关系。尽管目前这方面的具体研究成果不多,但已开拓了我们的视野。
王氏[20]采用基因芯片技术对人类证候进行了研究,并获得了一批差异基因表达数据,如用18000个点的基因芯片从肾阳虚证患者和正常人的比照研究之中筛选出差异表达基因1950条；用基因芯片技术对同一家系中虚寒证患者和正常人进行基因表达谱检测,发现此虚寒证家系中虚寒证患者与能量等代谢相关的差异表达基因达15个。高氏等[21]检测糖尿病家系中肾阴阳两虚血瘀证糖尿病患者与同家系中正常人,发现差异基因446条,其中包括与代谢、细胞凋亡、细胞周期、糖尿病相关基因和与传统中医理论肾的功能、血瘀相关基因。王氏等[22]应用基因芯片技术研究证实,脾虚证实质涉及大脑皮层和海马的基因表达谱改变,但与大脑皮质比较海马的基因表达改变少。盛氏等[23]观察了den诱发大鼠肝癌过程中,不同时期与不同治法对肝脏基因芯片表达特征,发现在芯片的15710个基因中,正常组有9225个基因表达,诱癌4周表达增至9396个,8周增至9872个,16周增至10496个,20周有10420个。此外,潘氏等[24]进一步对不同证候的h22肝癌荷瘤小鼠进行了外显子芯片检测,发现不同证候小鼠肾上腺等组织有大量的独特差异表达基因,如筛选阳气虚证独特上调基因52条、独特下调基因11条；气阴阳虚证独特上调和下调基因分别为23条和4条。
以上芯片结果获得部分差异基因,但目前对这些差异基因的比较、分析、验证、重复等后续报道较少。笔者认为,考虑到基因芯片数据海量,研究者重点关注的是不同证候特征性差异表达基因,基于不同证候与正常的比值差异及基因的相对表达量(芯片读数计算值)这2个基本条件,去筛选证候形成的主效应基因,然后开展后续的验证研究才是基因组学技术在证候本质研究中的价值所在,对阐明证候的物质基础才具有真实的学术意义。
3.2 蛋白质组学技术在证候研究中的运用
蛋白质组最早是由澳大利亚macquarie大学的wilkins和williams于1994年首先提出的。蛋白质组是指一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分,它研究不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体,以揭示生命活动的基本规律。
蛋白质组学技术能否应用于中医证候本质的研究呢？余氏等[25-26]分别从认知和技术的可行性分析,认为蛋白质组学与中医辨证论治的认识方法相似,是从整体的角度出发,分析细胞内所有动态变化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态,是从基因层面向蛋白质层面的深化,有利于动态地揭示同一个研究对象不同时期的变动性,更符合证候的特点。目前,蛋白质组学技术在中医证候研究是一个新的热点。例如,马氏等[27-28]用蛋白质组学技术研究四物汤对60co γ射线造成血虚证小鼠血清蛋白和骨髓蛋白的影响,发现四物汤可使血虚证小鼠血清中12个下调的蛋白点和4个上调的蛋白点有所恢复,可逆转血虚证小鼠骨髓10个上调和5个下调的蛋白质。梁氏等[29]研究肾阳虚证小鼠,发现了肾脏中大量有代表意义的差异蛋白质点。卢氏等[30]对肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组研究表明,肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关。谢氏等[31]对脂多糖致热毒血瘀证大鼠的血清进行了二维电泳分离分析,发现有13个蛋白点出现非常明显的含量变化。张氏等[32]对高血压肝阳上亢大鼠模型脾的单个核细胞的蛋白质组进行了分析,结果在高血压肝阳上亢大鼠中检测到497个点,其中为其独自所有的点有387个,并认为可能与高血压肝阳上亢证候相关。谭氏等[33]采用蛋白质组学技术研究抑郁症、经前期综合征、更年期综合征3种疾病肝郁证血清指标,结果发现了12个差异蛋白质点及其与疾病的关系。尽管以上不同证候与有关蛋白质的关系被初步发现与阐明,但这些蛋白质能否代表证候的特征、是否具有特异性、重复性又如何等诸多问题尚不能定论,因而笔者建议,学术界对这些蛋白质与证候关系的后续深入研究是重点,以获得可信、稳定、真实的证候物质基础。
3.3 代谢组学技术在证候研究中的运用
代谢组学是英国nicholson教授及其同事于1999年正式提出的,它是在机体新陈代谢的动态过程中,系统研究一个细胞、组织或器官所有代谢组分,尤其是分子质量为1000以下小分子的变化规律,以揭示机体生命活动的代谢本质。代谢组学研究的样品通常为血液、尿液等,通过检测其代谢组分以了解体内的异常代谢状态,因而具有整体性、终端性及动态性等特征。目前,代谢组学技术主要用于现代医学及中药现代研究中,如在肿瘤机制研究、冠心病诊断、药物对肝毒性研究等方面的应用；此外,在实验动物模型的评价及外源物产生的一系列代谢过程、作用机制、靶器官的效应、组织损伤等研究中也被应用[34]。
代谢组学作为一门新发展的技术,同基因组学和蛋白质组学一样,属于系统生物学的重要组成部分,它能否应用于中医证候本质的研究？王氏等[35]认为,代谢组学对证候模型的评价起到客观化作用,通过建立动物体液的“代谢指纹图谱”,在主成分分析法基础上,比较证候模型动物的体液代谢图谱,分析代谢模式差异性,有可能寻找到代谢网络缺陷的重要生物标志。相比基因组学和蛋白组学而言,目前,代谢组学技术在中医证候研究案例较少。罗氏等[36]报道,采用超导傅立叶变化核磁共振波谱仪检测肝郁脾虚模型大鼠血浆,对其代谢物组的共性分析和生物标记物进行主成分分析,结果发现,各组动物代谢谱各不相同,肝郁脾虚证大鼠血浆醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。贾氏等[37]采用代谢组学研究肾阳虚模型动物,发现其代谢网络明显偏离正常动物,经温阳中药干预后,肾阳虚动物的代谢谱回归至正常范围,呈现网络修复的结果。
总之,现代系统生物学理论与技术在中医证候本质研究中已被运用,其中基因组学与蛋白质组学技术在证候研究中运用最广泛,可能与基因芯片等技术的成熟、稳定等有关,而代谢组学在证候研究中相对较少。由于基因组学和蛋白质组学研究分别在基因转录和蛋白质层面揭示可能发生的事件,更具有动态的特征,而代谢组学则反映确实已经发生了的事情,突出机体整体性与终端特征。因而笔者建议,在证候本质的研究中,将这3种“组学”技术联合运用,将对证候本质的阐明具有十分重要的学术意义。
4 展望
中医证候本质的研究是一项长期、艰巨又重大的关键科学问题。纵观以往中医药工作者的研究积累,我们可以清楚地看出,不少中医药工作者已提出了系统生物学技术在证候研究中的思路[38-41],业已开展了证候本质的探索。但目前尚处于研究的前期阶段,重复且可靠的证候物质基础尚未发现,一些报道与证候有关的散在分子指标可能尚具有组织特异性。
那么,如何全面揭示证候的客观本质呢？从中医学的整体观、辨证论治思维与系统生物学的学科特点,可以考虑基于以下几点：①“组学”技术不是对个别基因或个别蛋白、代谢物的研究,而是对一个细胞或整个生命体的基因以及它所编码的蛋白质和代谢产物的研究；②基因转录翻译成蛋白质的过程中存在着剪接、加工修饰、构象变化和转运定位等蛋白质活动规律的变化,因而证候的基因转录水平并不能完全代表证候的蛋白质水平状况；③代谢组学强调把机体作为一个完整的系统来研究,符合证候的特征。因而我们推测,证候的物质基础可能是由功能相关的基因群或蛋白质群体表达异常及特异代谢组分共同构成。由此,在证候本质的研究中引入并联合采用基因组学、蛋白质组学和代谢组学等现代系统生物学理论和技术对目标组织同步检测,以获得证候基因表达谱、证候总体蛋白质表达图谱、证候相关代谢群谱,再运用生物信息学技术将这3张图谱与证候进行关联分析,从而更全面、更确切地揭示证候的动态发生机制。
关于证候本质研究的未来发展趋势,我们建议,重点应该围绕“同病异证”和“异病同证”的证候进行整合系统生物学研究,在筛选到证候独特表达的差异基因、差异蛋白及差异代谢组分的基础上,进一步对这些基因、靶蛋白、代谢小分子之间的联系与相互作用进行深入探索,以鉴定证候的本质特征。
【参考文献】
[1] 方肇勤.辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证[m].上海：上海科学技术出版社,2006.100.
[2] 方肇勤,潘志强,汤伟昌,等.小鼠“四诊工作站”构建与操作标准探讨[j].上海中医药大学学报,2006,20(1)：42－46.
[3] 方肇勤,潘志强,付晓伶,等.小鼠四诊采集项目标准的建议[j].中国中医基础医学杂志,2005,11(9)：692－694.
[4] 方肇勤,潘志强,卢文丽,等.小鼠常见证候的辨证标准[j].中国中医基础医学杂志,2006,12(7)：508－510.
[5] 方肇勤,潘志强,卢文丽,等.大鼠、小鼠常见证候计量化辨证及方法的建立及其评价[j].中国中医基础医学杂志,2007,13(7)：502－505.
[6] 宋剑南.论中医证候基础研究的模式和方法[j].中国中医基础医学杂志,2007,13(2)：81－83.
[7] 沈自尹.我的科研历程和思考[j].中医杂志,2000,41(11)：690－692.
[8] 申维玺.论中医“证”的现代医学属性和概念[j].中医杂志,2001,42(5)：307－309.
[9] 王米渠.中医遗传学[m].西宁：青海人民出版社,1997.245－291.
[10] 王 忠,王 阶,王永炎.后基因组时代中医证候组学研究的思路[j].中国中西医结合杂志,2001,21(8)：621－623.
[11] 张立华,高学功.中医“证”与“辨证”之浅见[j].时珍国医国药, 2002,13(7)：412－413.
[12] 王永炎,张启明,张志斌.证候要素及其靶位的提取[j].山东中医药大学学报,2006,30(1)：627.
[13] 罗和古,陈家旭.代谢组学技术与中医证候的研究[j].中国中医药信息杂志,2007,14(5)：3－5.
[14] 吴苏冬,周冬枝,贾宗良,等.结肠癌脾虚证p53,bcl-2和bax的表达[j].第四军医大学学报,2003,24(12)：1111－1113.
[15] 胡 玲,劳邵贤.胃癌前病变p21ras,c-erbb-2,p53表达与中医证候的关系[j].世界华人消化杂志,2004,12(2)：262－265.
[16] 杨焕明.基因组学——中医药学现代化的一个切入点[j].医药世界, 2000,(8)：5－7.
[17] 宋为民,王明艳,徐 力.基因组学是中医现代化的最佳切入点[j].南京中医药大学学报,1999,15(4)：193－195.
[18] 沈自尹.21世纪——中西医结合走向后基因组时代[j].中国中西医结合杂志,2000,20(11)：808－810.
[19] 方肇勤.基因芯片技术现状及其在中医基础实验研究中的应用[j].上海中医药大学学报,2001,15(1)：17－19.
[20] 王米渠,杨丽萍,丁维俊,等.一个寒证家系中发现15个差异表达基因的报告[j].中医杂志,2006,47(2)：131－133.
[21] 高 黝,高 泓,王米渠.1个糖尿病家系肾阴阳两虚血瘀证糖尿病的差异表达基因分析[j].现代中西医结合杂志,2005,14(1)：1－5.
[22] 王 肃,邹世洁,陈小野,等.利血平脾虚证模型海马基因表达谱变化的研究[j].现代中西医结合杂志,2004,13(7)：841－844.
[23] 盛学仕,方肇勤,管冬元,等.den诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变[j].中国中医基础医学杂志,2005,11(10)：737－746.
[24] 潘志强,方肇勤,卢文丽,等.阳气虚和气阴阳虚证荷瘤小鼠肾上腺基因表达的差异性[j].上海中医药大学学报,2008,22(3)：45－50.
[25] 余宗阳,杜 建.蛋白质组学与中医证实质研究[j].中国中西医结合杂志,2004,24(9)：844－846.
[26] 杨元宵,李昌煜.运用蛋白质组学研究中医证候的思考[j].中国实验方剂学杂志,2007,13(1)：69－72.
[27] 马增春,高 月,谭洪玲,等.四物汤对辐射致血虚证小鼠血清蛋白质表达的影响[j].中国中药杂志,2003,28(11)：1050－1053.
[28] 郭 平,马增春,李鹰飞,等.四物汤对放射线致血虚证小鼠骨髓蛋白质表达的影响[j].中国中药杂志,2004,29(9)：893－896.
[29] 梁 恒,邢建宇,刘希成,等.小鼠肾脏组织的双向电泳[j].西安交通大学学报,2004,38(2)：212－214.
[30] 卢德赵,沃兴德,施孟如,等.激素型肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组与能量代谢相关性[j].中国生物化学和分子生物学报,2005,21(6)：807－814.
[31] 谢文光,马晓昌,邵宁生,等.赤芍治疗热毒血瘀证的血清蛋白质组变化的初步研究[j].中国中西医结合杂志,2005,25(6)：520－524.
[32] 张 娴,李 伟,曾 星,等.高血压肝阳上亢大鼠模型单个核细胞蛋白质组的二维电泳分析[j].中华中西医杂志,2003,4(13)：1929－1931.
[33] 谭秦湘,吕志平,钟小兰,等.肝郁证辨证与相关蛋白关系初步研究[j].辽宁中医杂志,2006,33(2)：157－158.
[34] 刘昌孝.代谢组学与中药现代研究[j].河南大学(医学版),2006,25(3)：1－7.
[35] 王桐生,谢 鸣.代谢组学与中医药现代研究[j].中医杂志,2006,47(10)：723－725.
[36] 罗和古,丁 杰,岳广欣,等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[j].中西医结合学报,2007,5(3)：307－313.
[37] 贾 伟,蒋 健,刘 平,等.代谢组学在中医药复杂理论体系研究中的应用[j].中国中药杂志,2006,31(8)：621－624.
[38] 金光亮.证候基因组学和证候蛋白质组学浅论[j].中国医药学报, 2003,18(6)：332－335.
1.1基因芯片技术产生的背景过去十余年里,随着人类基因组计划(HGP)的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。在GenBank数据库中已含有300万个序列,总数超过22亿个碱基对,其中包括19种不同生物体的完整序列、近9000个已知功能或已推测功能的人类基因序列。目前基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。然而如何充分利用新序列信息资源,怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能,成为生命科学工作者的共同课题。已建立的诸如North-ern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此,必须发展高通量(highthroughout)或平行监测基因表达的新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。早在80年代初期,有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。但直到1994年Pease等人创造的光导原位合成(light-directedsynthesis)高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后,才使该设想逐步成为现实。因此可以说光导ODTA化学合成法,为DNA芯片技术奠定了基础。
在DNA芯片获得突破之后,又建立了通过高速机器人(high-speedrobotics)将cDNA定位排列到支持物上的cDNA微阵列技术,产生了基因表达芯片,成为大规模研究基因功能的强有力手段。1997年Jones建立了“重述DNA测序法”(iterativeDNAsequencingmethod),通过使用Ⅱs类限制性内切酶和含有Ⅱs类RE识别区域的接合器,突破了DNA芯片只能分析单链DNA的限制,而可同时对多条双链DNA直接进行平行测序。基因芯片的发展与双色荧光探针杂交系统(two-colorfluorescentprobehybridization)的建立有密切关系。将两个不同样品的mRNA在反转录时用不同的荧光底物进行标记。两组样品的cDNA混合后进行杂交。对同一个探针位点,在两组不同的激发光下进行检测,获得该位点上两个不同样品的杂交信号,其比值经阳性对照(外参照)比值和组成型表达基因(内参照)比值的校正后,就是该基因在两个不同样品中差异性表达的比值。这类系统可以很好地克服检测过程中某些不稳定或不确定因素带来的不利影响,使差异性表达的研究高效而可靠[2,3]。在此基础上,近年来各色荧光标记底物也已不断出现。
1.2基因芯片的主要类型基因芯片的类型视分类方法不同可分为不同的类型。
1.2.1无机片基和有机合成物片基的基因芯片以基因芯片的片基或支持物(substrateorsupportmatrix)的不同可以分为无机片基和有机合成物片基,前者主要有半导体硅片和玻璃片等,其上的探针主要以原位聚合的方法合成;后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜,其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。
1.2.2原位合成和预先合成然后点样的基因芯片以探针阵列的形式分为原位合成(insitusyn-thesis)与预先合成然后点样(off-chipDNAsynthe-sis)两种。芯片制备的原理是利用照相平板印刷技术(photolithography)将探针排列的序列即阵列图“印”到支持物上,在这些阵列点上结合上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术,该技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透的结果。照相平板印刷中可用光引导形成电子线路(electricalcir-cuits),利用类似的原理可在固相支持物上同时合成出大量不同的化合物。预先合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似,合成工作用传统的DNA合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置或仪器(如美国的CartesionTechnologies公司的PixSysNQ/PA系列产品)将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的玻片上,点阵密度可达到3×104spots/cm2。
1.2.3基因表达芯片和DNA测序芯片根据芯片的功能可分为基因表达芯片或基因表达微阵列(geneexpressionmicroarry)和DNA测序芯片或重述DNA测序芯片(interativeDNAsequencingchip)两类。前者可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDN段固定在一块DNA芯片上,对来源于不同的个体(正常人与患者)、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测,从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确定,同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA测序芯片则是基于杂交测序(sequencingbyhybridization,SBH)发展起来的。SBH的原理是,任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸,又称亚序列(subsequence),如由8个核苷酸组成的8体亚序列。
例如,可以把序列TTAGCTCATATG分解为5个错开一个碱基而重叠7个碱基的8体亚序列(也可分为7体、9体或其他整数n体的亚序列)。假如我们能把原序列所有这些错落重叠的8体亚序列全部检测出来,就可据此重新组建出原序列。对于一个未知DNA序列,可以用人工合成的、已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与之杂交(在8体寡核苷酸中,G,C,T,A4者自由组合而成所有可能的序列共有48=65536种)。通过对杂交的检测,检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸,从而获知靶DNA中的所有8体序列,组合分析后者,即可重构靶DNA的序列。如前所述,重述DNA测序法的建立已克服了SBH只能测定单链和二级结构对SBH的限制。Affymetrix公司的测序芯片,即是将65536个8nt的寡核苷酸通过光刻的方法在芯片表面原位合成,获得一个微阵列矩阵,分辨率为50μm。而Chee等则将1.35×105个长度为15nt的寡核苷酸探针固定在芯片上,对长度为16.6kb的整个人线粒体基因组进行序列测定,每个检测位点包括一套4个探针。芯片分辨率为35μm,测序精度为99%。另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列(或cDNA微阵列芯片)和寡核苷酸阵列(或芯片),根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片(Toxchip)、病毒检测芯片(如肝炎病毒检测芯片)、P53基因检测芯片等。
1.3芯片杂交的检测方法对于以核酸杂交为原理的检测的主要过程为:首先用荧光素标记经扩增(也可用其他放大技术)的序列或样品,然后再与芯片上的探针进行杂交后冲洗。图像的分析用落射荧光显微镜(epifluorescencemicroscope),或电荷偶联装置照相机(charge-coupleddevicecamera)、非共聚焦激光扫描仪(nonconfocallaserscanner)等进行。目前应用较多的是美国GeneralScanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray3000),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集,由计算机处理荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray5000。
2在医学研究中的意义
2.1特异性相关基因的克隆寻找和鉴定疾病相关基因是从分子水平上研究疾病,揭示发病机制的一项重要基础性研究工作,利用基因芯片进行新基因克隆时,固定在芯片上的探针是某些cDNA文库内的cDN段。研究这些cDN段对应基因的差异性表达,就可能选到差异表达相关基因。如Schena等通过双色差示表达系统,研究人T淋巴细胞在热休克条件下和佛波酯作用下1046个未知序列的cDNA基因诱导表达的情况,并对诱导表达的cDNA进行测序,再与已知基因进行比较。结果发现,热休克诱导了已知的热休克蛋白基因的表达,其中包括分子伴侣和分子降解的中间体。同样,佛波酯引起了佛波酯调节基因的信号传导途径特征基因的表达,如激活细胞的磷酸酯酶和细胞因子κB1等。另外,还发现3个低表达的已知基因和4个低表达的新基因可能与该途径有关[4]。
2.2基因功能的研究研究基因功能,确定基因与基因间的相互关系,从而揭示疾病发生、发展的分子机制是医学研究的重要内容,也是基因表达芯片最重要的用途之一。Heller等采用基因表达芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性。分别用cyanine3(cyt3)和cyt5对类风湿关节炎组织和肠炎粘膜的cDNA进行标记后,与这两种疾病发生过程中目前已知可能起作用的基因阵列进行杂交,发现已知炎症相关基因,如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症相关基因的表达,如人基质金属弹性蛋白酶(humanmatrixmetallo-elastase)和黑素瘤生长刺激因子(melanomagrowthstimulatoryfactor)。同时,与一个来自外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状态基因差异表达的比较,发现在类风湿关节炎组织中金属蛋白酶组织抑制物1,铁蛋白轻链和锰超氧化物歧化酶表达明显升高[5]。通过该研究,确定了许多基因与这两种病变的关系,为治疗和发病机制的研究提供了新的思路。
2.3基因突变的检测肿瘤和遗传疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变。检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。DNA芯片技术是一项高效、准确的DNA序列分析技术,将DAN芯片用于检测分子突变,不仅可准确地确定突变位点和突变类型,更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法无法比拟的,它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变。如Chee等[6]用含有1.35×105个长度为25nt的寡核苷酸探针,分析了16.6kb的人类线粒体基因组DNA(mtDNA),共分析了10个样本,检测出了505个多态性位点,并在Leber′s遗传性视神经疾病患者的mtDNA中检测出3个致病性突变位点。Hacia等[7]在1.28cm×1.28cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20nt的寡核苷酸探针,用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11(3.45kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1～5bp)突变。针对每一个位点,共有28个独立的探针,14个针对有义链,14个针对反义链。14个探针包括2个野生型,3个碱基置换、4个插入突变、5个碱基缺失。在15例患者样品中,发现有14例有基因突变,类型包括点突变、插入及缺失等;在20例对照样品中均未检出假阳性结果。Cronin等[8]分别用两种DNA芯片检测囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)的突变,其中一个芯片包含1480个探针,检测了CFTR基因的第10和11外显子的已知突变,包括缺失、插入和单碱基置换,并分析了10个未知样品的CFTR基因,其结果与PCR-RELP的分析结果完全一致。DNA芯片还被用来检测β-地中海贫血患者的基因突变,并在β-球蛋白研究上检测出了3个突变位点。
2.4感染病毒的检测Affymetrix公司开发了HIV病毒检测芯片。国内博道公司已研制了检测丙型肝炎病毒(HCV)的基因芯片,他们选取40个HCV基因作为探针制备微阵列,对13个丙型肝炎患者血清和12个正常人血清样本进行检测,结果准确率达100%。
2.5毒理学研究Nuwaysir等[9]研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二噁英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片(ToxChipv1.0),该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物的毒作用机制的研究。最近,Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆,制备了种属特异的毒理基因组学芯片,可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制,也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。
